利用CRISPR/CAS技术定点编辑水稻花粉特异表达基因OsIPA
摘要：水稻雄配子发育是水稻得以繁殖的关键发育过程，同时水稻的雄性不育在水稻杂种优势利用中也发挥着重要作用。花药/花粉特异表达基因可能在雄配子发育中发挥关键作用。本研究利用CRISPR/CAS9技术对水稻品种明恢86中的花药特异表达基因OsIPA定点编辑，获得OsIPA突变体，以期研究OsIPA基因在水稻花粉发育过程中的功能。试验最终成功的对OsIPA基因第1外显子上的2个不同的靶位点进行了定点突变，经检测发现有24株T0代在相应的靶位点发生了突变，共有8种不同的类型，包括碱基缺失、替换以及单碱基的插入等不同类型。
关键词：水稻；CRISPR/Cas9；基因编辑；OsIPA
中图分类号：S 511文献标识码：A文章编号：1008-0384（2017）11-1173-05
Abstract： Male gamete development is an essential step in rice reproduction process， and male sterility is crucial for the utilization of rice heterosis. Since the anther or pollen specific genes in rice might play a pivotal role in the male gamete development， the functions of OsIPA were of great interest to the scientists. This study applied CRISPR/CAS9 to generate an OsIPA mutant for an investigation. Two sites in the 1st exon of OsIPA were selected as the targets. After sequencing， a total of 8 different types of mutant， including deletion，substitution and single nucleotide insertion， were found in 24T0 transgenic plants.
Key words：rice； CRISPR/Cas9； gene editing； OsIPA
水稻雄配子的发育是水稻生殖发育的重要环节。雄配子发育的失败一方面会导致雄性不育而不能正常繁殖，但另一方面，雄性不育在水稻雜种优势的利用中发挥重要作用，有着重要的应用价值。因此深入研究水稻雄配子发育调控的分子机制不仅有重要的理论意义，也能为水稻雄配子育性的人工调控提供理论基础。水稻花药由外自内依次由表皮层、内层、中间层和绒毡层等4层细胞组成，花粉在绒毡层中发育。目前已鉴定的影响雄配子发育的基因包括调控小孢子形成之前的各发育时期的如控制早期造孢细胞发育的MSP1[1]和OsTDL1A[2]、控制减数分裂的PAIR1、PAIR2、PAIR13、OsRAD214、OsDMC1、ZEP1、PSS1、OsREC8、MIL、OsCOM1、OsSGO1、OsAM1等[3]、调控绒毡层发育的Udt1[4]和TDR[5]、MTR[6]、PTC1[7]、DTC1[8]，以及调控花粉粒淀粉合成及花粉壁形成的WDA1[9]、RIP1[10]等。除此之外，还有一些基因同时在多个发育途径中发挥作用，如DTM1基因，编码一个禾本科植物特有的内质网膜蛋白，同时调控绒毡层及减数分裂过程。在绒毡层发育的调控时期位于MSP1之后而在UDT1之前，而对减数分裂的调控时间位于MEL1之后，PAIR1之前[11]。
水稻雄配子发育过程中包括花药的形成，绒毡层的正常发育及特定时期的细胞程序性死亡，花粉粒中淀粉的充实及花粉外壁形成等众多环节，该过程涉及相关基因的协调顺序表达。据报道，在拟南芥中，成熟花粉中表达的基因有5 000～7 000个，整个花粉发育过程则有近14 000个基因[12]。Hobo 等[13]（2008）等利用激光微分离技术（Laser Microdissection， LM）显微水平上分别对花药的各层细胞单独进行转录组进行分析，发现有28141在水稻花药中表达，其中2468个基因在花药中优势表达。类似地，Suwabe 等[14]（2008）对不同发育时期的绒毡层细胞和小孢子分别进行转录组分析，将前期鉴定了140个花药特异表达基因进一步进行了细分，其中71个基因为雄配子特异表达，7个为绒毡层特异表达，62个在绒毡层和雄配子中都有表达。Tang等（2010）则利用LM技术鉴定了1158个水稻花粉母细胞优势表达基因[15]。水稻雄配子发育特定阶段以及特定组织的基因表达谱分析工作为水稻雄配子发育的分子机理研究奠定了良好的基础。虽然目前已鉴定了一些雄性不育基因，但相对于数目巨多的花药/花粉特异表达基因而言，还有大量的基因功能有待阐明。近年来兴起的以CRISPR/CAS9为代表的基因组编辑技术为实现该目标提供了有效的手段。目前已成功地对包括水稻在内的多种植物进行了定点编辑，实现了基因的定向突变，是研究基因功能的强有力工具。OsIPA基因是Gupta等[16]从水稻开花前穗cDNA中筛选出来的一个仅在花粉中特异表达的基因，该基因编码一个细胞壁扩展蛋白或花粉过敏源（expansins/pollen allergen）。Northern杂交、原位杂交及组织化学染色等多种手段都表明其在花粉发育后期至开花期都有表达[16-17]。但目前尚不清楚OsIPA基因在水稻花粉发育起着何种作用。
1材料与方法
11试验材料
使用本实验室保存籼型水稻品种明恢86作为转化受体。CRISPR/CAS9载体VK00501购自北京唯尚立德生物科技有限公司。大肠杆菌DH5α、农杆菌LBA4404均为本实验室留存。
12基因编辑靶位点选择及载体构建
根据水稻OsIPA基因（LOC_Os10g40090）的外显子序列，选取PAM（protospaceradjacent motif）序列（NGG）前20 nt的寡核苷酸作为靶序列，将该段序列和水稻基因组数据库比对，选择特异性高的靶位点，特别是排除那些近PAM区序列有非特异位点同源的序列。
载体构建根据试剂盒提供的方法，将每个靶点一对的23nt的寡核苷酸链的正反向引物等量混合（终浓度2 μmol·L-1），在PCR仪上95℃变性3 min，以3℃·min-1的降温速度缓慢降温，最后16℃ 5 min形成引物二聚体的形成。取上述二聚体1 μL，Cas9/gRNA载体03 μL，Solution 1和Solution 2各1 μL，补充超纯水至反应体系到10 μL。16℃连接2 h。热激法转化大肠杆菌DH5α。挑选5个单克隆转化子测序验证，将正确的质粒通过电激法转化农杆菌LBA4404。
13农杆菌介导的遗传转化及转基因后代突变位点分析
转基因采用农杆菌介导的遗传转化法。转基因植株总DNA采用CTAB法提取。转基因植株的阳性鉴定采用位于CAS9载体上的1对引物CAS9F和CAS9R进行扩增，引物序列为CAS9F：5′GGG AGA TCC AGC TAG AGG TC3′，Cas9R：5′GGA AGG AGG AAG ACA AGG3′，扩增片段长度为536 bp。对转基因阳性植株，利用位于2个靶位点两侧的引物OsIPA1F和OsIPA1R進行PCR扩增，引物序列为OsIPA1F：5′ATG TAC GAA TGC ATG TCC TC3′，OsIPA1R：5′ATC TGC TTG ATC TTG TCA TC3′。扩增产物直接测序后和原始序列比对，并结合刘耀光课题组研发的序列解码方法[18]（http：//dsdecode.scgene.com/home/）检测靶序列是否发生突变以及突变类型。
2结果与分析
21靶位点设计及CAS9表达载体构建
为利用基因组编辑技术CRISPR/CAS9技术定点突变水稻花粉特异表达基因OSIPA，利用北京唯尚立德公司VK00501构建基因编辑载体。试验在OSIPA基因的第一外显子上设计了2个不同的靶位点，靶位点1为ttgtagttggtcgtgatgtt，位于起始密码子下游100～119 bp处，PAM序列为CGG，靶位点2为cgaccaactacaacgccccg，位于起始密码子下游110～129 bp，PAM序列为tgg，以最大限度破坏OsIPA的功能。
22突变体筛选及花粉育性观察
利用CTAB法提取T0代转化植株的叶片DNA，利用Cas9F和Cas9R引物扩增筛选出阳性植株（图1）。靶位点1和2分别获得36株和20株再生苗，阳性的植株分别有26株和11株。利用同时包含2个靶位点的一对引物OsIPA1F和OsIPA1R对T0代转基因阳性样品进行靶位点扩增，PCR产物直接sanger测序分析目标靶位是否发生突变。结果表明，靶1和靶2分别有13株和11株发生了突变，突变率分别为50%和100%。其中靶1有3种不同类型的突变体，分别为插入T碱基纯合突变、缺3 bp及插入A碱基的双等位杂合突变以及缺5bp及19 bp替换的双等位杂合突变。靶2也有3种不同类型的突变，分别为插入T碱基纯合突变、插入C碱基纯合突变以及插入T碱基和缺失15 bp的双等位杂合突变。突变类型见图2。
在T0代植株抽穗时取即将开花的小穗，用1%的I2IK溶液对花粉镜检观察，但所有植株花粉染色均正常。为进一步观察OsIPA基因突变后是否会影响花粉育性，对靶位点1的3种不同类型突变体的T1代植株靶位点进行测序分析，鉴定得到了插入A、插入T及缺失GATGT共5 bp等3种不同类型的纯合突变体，上述突变体花粉I2IK染色均正常，和野生型明恢86一致（图3）。
3讨论和结论
花粉发育是水稻生殖发育过程中的重要环节，正常的花粉发育保证了水稻的生产和繁殖。水稻作为单子叶模式生物，其花粉发育的分子调控机制一直是发育生物学的研究热点之一。另外水稻花粉育性和生产也密切相关。一方面要研究如何避免高温等不利环境因素影响花粉育性从而导致水稻结实率和产量下降，另一方面则要提供完全雄性不育的水稻材料用来生产杂交种。因此，深入研究花粉发育的分子调控机制也将为生产实际提供坚实的理论支撑。
为发掘在花粉发育中的关键基因的功能，通过鉴定雄性不育突变体发掘了大量的雄性不育基因。另一方面，通过反向遗传学也是一个重要手段。前人通过对花药或花粉特异或优势表达基因进行反义或RNAi等技术手段降低基因表达量鉴定了诸如UGP1[19]、UGP2[20]、RAFTIN[21]等雄性不育基因。目前随着基因组编辑技术CRISPR/CAS9的兴起，为鉴定数目巨大的雄配子发育阶段特异表达基因的功能提供了更为有效的手段。CRISPR/CAS9技术是继锌指核酸酶（ZFNs）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）之后发展出来的新一代基因编辑技术。该技术能在基因组水平定点突变目的基因。和早期的技术相比，CRISPR/CAS9技术具有载体构建简便，技术门槛低，并且突变效率高，突变类型丰富。在水稻中目前已对香味基因OsBADH2[22]、千粒重基因TGW6[23]、温敏雄性不育基因tms5[24]等大量基因进行了定点突变，获得了稳定的突变体，在水稻的遗传改良及基因功能鉴定等方面发挥了重要的作用。
本研究对OsIPA第一外显子2个不同的靶位点进行了定点突变，获得了不同类型的突变，除了缺失3 bp、缺失15 bp及19 bp替换等3种类型外，其余突变均会引起突变位点之后的氨基酸发生移码突变，导致基因功能的改变。多篇文献报道均表明：OsIPA是仅在花粉中特异表达的基因[16-17]，推测其应和花粉的发育相关，携带突变型OsIPA的花粉可能会不正常发育，导致无法获得纯合型的突变体。但本研究通过对T0及3种不同突变类型的T1代的观察表明，突变体育性正常，且植株的形态特征和野生型也无明显变化。推测可能的原因是该基因存在基因的功能冗余，OsIPA基因功能缺失后可能有其他功能相同的基因进行弥补。后续研究将通过转录组学比较突变体和野生型花粉发育阶段的基因表达的差异，寻找差异基因并分析差异表达基因和OsIPA之间的关系。
本研究為探索水稻花粉特异表达基因OsIPA在花粉发育过程中的作用，采用CRISPR/CAS9技术定向突变了OsIPA基因，获得了稳定的突变体，为进一步的功能分析奠定了材料基础。
参考文献：[1]
NONOMURA K I， MIYOSHI K， EIGUCHI M， et al. The MSP1 gene is necessary to restrict the number of cells entering into male and female sporogenesis and to initiate anther wall formation in rice[J]. Plant Cell， 2003， 15（8）： 1728-1739.
[2]ZHAO X， PALMA J D， OANE R， et al. OsTDL1A binds to the LRR domain of rice receptor kinase MSP1， and is required to limit sporocyte numbers[J]. Plant Journal， 2008， 54（3）： 375-387.
[3]GUO J X， LIU Y G.Molecular control of male reproductive development and pollen fertility in rice[J].J Integr Plant Biol，2012， 54（12）：967-978.
[4]JUNG K H， HAN M J， LEE Y S，et al. Rice Undeveloped Tapetum1 is a major regulator of early tapetum development[J]. Plant cell，2005， 17（10）： 2705-2722.
[5]LI N， ZHANG D S， LIU H S， et al. The rice tapetum degeneration retardation gene is required for tapetum degradation and anther development[J]. Plant Cell，2006， 18（11）： 2999-3014.
[6]TAN H， LIANG W， HU J， et al.MTR1 Encodes a Secretory Fasciclin Glycoprotein Required for Male Reproductive Development in Rice[J].Developmental Cell， 2012 ， 22 （6） ：1127-1137.
[7]LI H， YUAN Z， VIZCAYBARRENA， et al. PERSITENT TAPETAL CELL1 encodes a PHDfinger protein that is required for tapetal cell death and pollen development in rice[J].Plant physiology， 2011， 156（2）：615-630.
[8]YI J， MOON S， LEE S， et al. Defective Tapetum Cell Death 1 （DTC1） Regulates ROS Levels by Binding to Metallothionein during Tapetum Degeneration[J]. Plant physiology， 2016，170（3）： 1611-1623.
[9]JUNG K H，HAN M J， LEE D， et al. Waxdeficient anther1 Is Involved in Cuticle and Wax Production in Rice Anther Walls and Is Required for Pollen Development[J]. Plant Cell， 2006 ， 18 （11） ：3015-3032.
[10]HAN M J， JUNG K H， YI G， et al. Rice Immature Pollen1（RIP1） is a regulator of late pollen development[J]. Plant cell physiology， 2006，47（11）： 1457-1472.
[11]YI J， MOON S， HWANG I，et al.. The rice gene DEFECTIVE TAPETUM and MEIOCYTES 1 （DTM1） is required for early tapetum development and meiosis[J]. Plant Journal，2012，70（2）： 256-270.
[12]BORG M， BROWNFIELD L， TWELL D.Male gametophyte development： a molecular perspective[J].J Exp Bot， 2009， 60（5）：1465-1478.
[13]HOBO T， SUWABE K， AYA K， et al. Various spatiotemporal expression profiles of antherexpressed genes in rice[J]. Plant Cell Physiol， 2008，49（10）：1417-1428.
[14]SUWABE K， SUZUKI G， TAKAHASHI H， et al. Separated Transcriptomes of male gametophyte and tapetum in rice：balidity of a laser microdissection（LM） microarray[J]. Plant Cell Physiol， 2008， 49（10）：1407-1416.
[15]TANG X，ZHANG Z Y， ZHANG W J， et al. Global gene profiling of lasercaptured pollen mother cells indicates molecular pathways and gene subfamilies involved in rice meiosis[J].Plant Physiology， 2010， 154 （4） ：1855-1870.
[16]GUPTA V，KHURANA R，TYAGI A K.Promoters of two antherspecific genes confer organspecific gene expression in a stage-specific manner in transgenic systems[J]. Plant Cell Reports，2007，26：1919-1931.
[17]SWAPNA L， KHURANA R， VIJAYA KUMAR S， et al.PollenSpecific Expression of Oryza sativa Indica Pollen Allergen Gene （OsIPA） Promoter in Rice and Arabidopsis Transgenic Systems[J]. Mol Biotechnol，2011， 48（1）：49-59.
[18]MA X， CHEN L， ZHU Q， et al. Rapid decoding of sequencespecific nucleaseinduced heterozygous and biallelic mutations by direct sequencing of PCR products[J]. Mol Plant， 2015， 8（8）： 1285-1287.
[19]CHEN R， ZHAO X， SHAO Z， et al.Rice UDPGlucose Pyrophosphorylase1 Is Essential for Pollen Callose Deposition and Its Cosuppression Results in a New Type of Thermosensitive Genic Male Sterility[J]. Plant Cell，2007，19（3）：847-861.
[20]MU H，KE J，LIU W，et al. UDPglucose pyrophosphorylase2 （OsUgp2）， a pollenpreferential gene in rice， plays a critical role in starch accumulation during pollen maturation[J]. Chinese Science Bulletin， 2009， 54 （2） ：234-243.
[21]WANG A， XIA Q， XIE W， et al.The classical Ubisch bodies carry a sporophytically produced structural protein （RAFTIN） that is essential for pollen development[J]. PNAS， 2003，100（24）： 14487-14492.
[22]邵高能， 謝黎虹， 焦桂爱，等. 利用CRISPR/CAS9技术编辑水稻香味基因Badh2[J]. 中国水稻科学， 2017， 31（2）：216-222.
[23]王加峰， 郑才敏， 刘维，等. 基于CRISPR/Cas9技术的水稻千粒重基因tgw6突变体的创建[J]. 作物学报， 2016， 42（8）：1160-1167.
[24]ZHOU H， HE M， LI J， et al. Development of Commercial Thermosensitive Genic Male SterileRice Accelerates Hybrid Rice Breeding Using the CRISPR/Cas9mediated TMS5 Editing System[J]. Scientific Reports， 2016，6：37395.
（责任编辑：柯文辉）