猫耳刺皂苷ilexpernoside,C抑制低密度脂蛋白多聚体诱导泡沫细胞形成的活性及机制研究

材料

1.1植物原料猫耳刺I. pernyi采自湖北神农架，由北京大学药学院天然药物学系屠鹏飞教授鉴定。凭证标本（MEC0504）存放于北京大学中医药现代研究中心标本室。猫耳刺三萜皂苷ilexpernoside C（IC1）由本实验室制备^[6]，结构见图1，纯度>95%。

1.2细胞人源单核巨噬细胞细胞系THP-1由本室保存。

1.3药品与试剂细胞培养皿和培养板（美国Corning公司）；RPMI-1640细胞培养液，0.25%胰酶，标准胎牛血清，丙酮酸钠，10 × PBS（美国Hyclone公司）；超滤膜（美国Millipore公司）；BSA，佛波酯（PMA），Dil（1，1′-dioley 1-3，3，3′，3′-tetramenthy-lindocarbocyaninemethanesul-phonate），Atorvastatin（美国Sigma公司）；Trizol，DEPC（美国Iinvitrogen公司）；SYBR green（上海东方科技发展有限公司）；Taq DNA聚合酶（上海生工生物公司）；RNase I（美国Promega公司）；Proteinase K（德国Merck公司）；反转录试剂盒Superscript_TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit（美国Invitrogen公司）；其余试剂均为国产分析纯试剂。引物序列见表1。

2方法

2.1细胞培养THP-1细胞用含有10%胎牛血清，100 U·mL^-1青霉素和100 mg·L^-1链霉素的1640培养液培养，在37 ℃，5% CO₂条件下培养。细胞悬浮生长并每3 d传代1次。细胞活性用MTT法检测^[7]。THP-1细胞以1×10₆个/mL的密度接种到96孔板，用佛波酯（0.16 μmol·L^-1，PMA）37 ℃孵育细胞48 h刺激其分化为巨噬细胞^[8]。

2.2LDL的纯化、修饰和聚集根据以前报道的方法，利用密度梯度超速离心法，从人血浆中分离得到LDL^[9]。得到的LDL经过0.45 μm滤膜过滤后，在含有1 mmol·L^-1 EDTA的PBS溶液中与0.4 μg Dil（1，1-dioctadecyl-3，3，3，3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate）37 ℃孵育24 h。Dil-LDL通过与之前相同的离心和透析方法进行纯化，使用前避光4 ℃保存。纯化的Dil-LDL通过涡旋1 min进行聚集，接着用超声破碎仪冰上破碎大的聚集体，0.45 μm滤膜过滤。由此产生的Dil标记的聚集体LDL（Dil-aggLDL）在30～75 nm能最大限度的被THP-1细胞吞噬和吸收。

2.3IC1干预THP-1细胞对aggLDL吞噬试验已分化贴壁的THP-1细胞与IC1和10 mg·L^-1的Dil-aggLDL（或aggLDL）在37 ℃避光孵育细胞24 h。IC1和阿托伐他汀溶解在DMSO中，以细胞培养液稀释至终浓度为1～500 μmol·L^-1，分别用于细胞毒性、量效关系和作用机制的考察。对照组细胞仅与Dil-aggLDL（或aggLDL）孵育，并加入等量的DMSO。经过处理后的细胞用冰冷的含有0.2% BSA的PBS清洗2次，用PBS清洗一次后，进行下一步实验。

2.4细胞荧光分析单核巨噬细胞THP-1经过吞噬培养液中的Dil-aggLDL成为泡沫细胞。泡沫细胞中的脂滴沉积通过荧光显微镜进行原位检测。每孔随机选择5个视野，进行拍照。

2.5流式细胞检测细胞经过Dil-aggLDL和IC1处理和清洗之后，收集细胞悬液通过滤器，过滤后上机分析。

2.6细胞抑制率计算细胞经过一系列浓度（根据化合物的抑制效果确定）的IC1处理后，通过流式细胞计数，确定药物对细胞荧光的抑制率。药物的荧光抑制率=1-给药组荧光强度/对照组荧光强度。通过Graphpad software计算IC₅₀和95%置信区间。

2.7IC1对Dil荧光的影响作用在细胞培养液中分别加入10 mg·L^-1的Dil-aggLDL和IC1（200，500 μmol·L^-1）或阿托伐他汀（100 μmol·L^-1），在黑暗中37 ℃孵育24 h之后溶液中的荧光强度由荧光分光光度计测定。测定参数为：激发波长549 nm；发射波长565 nm。

2.8mRNA表达分析在6孔板中培养并刺激THP-1细胞分化后，用Trizol试剂分别提取各组细胞的RNA，纯度检测显示A₂₆₀/A₂₈₀在1.8～2.0，符合RNA样品检测要求。RT-PCR采用20 μL逆转录反应体系按照试剂盒说明进行。然后对低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）、低密度脂蛋白受体相关蛋白1（low density lipoprotein receptor related protein 1，LRP1）、三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）和三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G1（ATP binding cassette transporter G1，ABCG1）的基因进行Real-time PCR扩增，利用CT值计算相对表达水平。mRNA表达水平根据Real-time PCR中GAPDH的循环阈值（CT）进行修正，公式为2_⊿CT（⊿CT=CT_GAPDH-CT_{gene of interest}）。

2.9统计方法采用Graphpad Prism软件进行，实验数据以±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），2组数据间差异比较采用Student′s t检验，P<0.05为统计学差异显著。

3结果

3.1IC1对THP-1细胞毒性试验鉴于IC1的细胞毒性可能对THP-1细胞的吞噬作用产生影响，用MTT法对高浓度IC1的细胞毒性进行考察。200，500 μmol·L^-1的IC1与PMA分化后的THP-1孵育24，48 h后，用MTT法检测细胞存活率。结果显示，经过高浓度的IC1孵育后，THP-1细胞活性均>95%，对细胞没有明显的毒性作用，见图2。

3.2化合物IC1对aggLDL诱导的THP-1细胞脂质沉积的抑制作用按照实验方法所述，分析了IC1对Dil荧光标记的aggLDL诱导THP-1细胞脂质沉积的抑制作用，THP-1细胞接种到细胞培养板，经过PMA刺激后，细胞贴壁并分化为巨噬细胞。不同浓度的IC1和阿托伐他汀（Ator）分别与培养液中含有Dil-aggLDL（10 mg·L^-1）的THP-1细胞共同孵育24 h后，对细胞进行清洗、图像采集和荧光强度分析。以只含有Dil-aggLDL孵育的细胞为模型组，以阿托伐他汀为阳性药。倒置荧光显微镜结果显示，IC1能剂量依赖地抑制细胞内的荧光强度，见图3。此外，利用流式细胞检测定量分析细胞内的荧光强度，并计算荧光抑制率，IC1与阿托伐他汀对细胞内荧光的抑制率IC₅₀分别为54.89，29.67 μmol·L^-1，见图4。结果显示，IC1和阿托伐他汀都能显著抑制细胞的脂质沉积，阿托伐他汀的抑制效果优于IC1。

3.3化合物IC1对Dil荧光强度的影响为了排除IC1对Dil荧光的直接淬灭作用，本实验对高浓度IC1和Dil荧光探针间的相互作用进行了验证。在含有Dil-aggLDL（10 mg·L^-1）的细胞培养液中分别加入200，500 μmol·L^-1的IC1或阿托伐他汀。细胞培养液在暗处37 ℃孵育24 h后，用荧光分光光度计检测各溶液的荧光强度。结果显示，IC1和阿托伐他汀对Dil的荧光强度都没有影响，见图5。

3.4IC1对THP-1脂质吸收相关受体mRNA表达的影响药物对泡沫细胞形成的干预过程可能通过2种方式实现，即抑制细胞对aggLDL的摄入或促进细胞对aggLDL排出，所以本实验对这2种机制的相关蛋白的表达水平进行验证。猫耳刺皂苷IC1分别与含有和不含aggLDL的THP-1细胞共同孵育24 h，用Real-time PCR检测THP-1细胞对aggLDL吞噬相关基因的LRP1和LDLR和胆固醇外排相关蛋白ABCA1和ABCG1的mRNA表达水平进行检测。实验以无aggLDL的细胞为正常组（CG），以只添加aggLDL的细胞为造模组（HG），不同浓度IC1给药24 h后，检测相关基因的mRNA表达水平，以GAPDH mRNA为参比进行统计。细胞经过aggLDL诱导之后，LRP1，LDLR，ABCA1，ABCG1的mRNA表达水平都显著上升；而化合物IC1剂量依赖地抑制了LRP1的mRNA表达水平，而对LDLR的表达水平没有影响，对ABCA1，和ABCG1表达有降低的趋势，但没有剂量依赖性，见图6。提示化合物IC1抑制THP-1对aggLDL的吞噬作用，其作用机制之一是通过抑制LRP1基因的表达实现的。

4讨论

动脉粥样硬化（As）是心血管疾病的常见类型，泡沫细胞是动脉粥样硬化斑块内出现的特征性病理细胞。As早期单核细胞首先粘附于血管内皮，然后迁移至内皮下分化为巨噬细胞。后者主要通过清道夫受体无节制地吞噬大量修饰的LDL，形成泡沫细胞，进而堆积成动脉粥样硬化斑块。因此巨噬细胞来源的泡沫细胞在血管壁上的堆积，是动脉粥样硬化的主要成因^[10]。

本实验对此病理过程进行了体外模拟，单核细胞THP-1经过PMA刺激分化为巨噬细胞，之后在细胞培养液中添加aggLDL，分化后的THP-1巨噬细胞大量吞噬培养液中的aggLDL形成泡沫细胞。在人体内，正常的LDL几乎不被巨噬细胞吞噬，而那些经过修饰的LDL却极易被吞噬形成泡沫细胞^[11]。一般修饰后的LDL有氧化、聚集体等多种形式，除LDL的自然聚集外，经过氧化后的LDL也趋于聚集，因此聚集体LDL（aggLDL）被本实验用以诱导泡沫细胞的形成^[12]。同时，为了能快速简便地观察到脂质在细胞中的沉积情况，本实验对aggLDL进行了Dil荧光标记，所以被细胞吞噬的Dil-aggLDL能在荧光显微镜下被清晰地观察和成像，同时也便于流式细胞检测和定量。为了排除化合物对荧光的直接淬灭作用，各高浓度的化合物被分别与Dil-aggLDL在细胞培养液中孵育后，再检测培养液中的荧光强度，结果显示，和对照组相比，药物对Dil的荧光强度没有干扰。

化合物IC1抑制aggLDL诱导巨噬细胞脂质沉积的机制，可能是抑制细胞吞噬脂质或促进细胞内胆固醇的排出。为了阐明其作用机制，本实验分别检测了胆固醇胞吞和胞吐作用相关蛋白的mRNA水平。结果显示，IC1剂量依赖地降低了影响细胞内吞作用的LRP1，虽然ABCA1和ABCG1的表达水平也受到了抑制，但是不具有剂量依赖性。通过以上结果推断，LRP1是IC1的直接作用靶点，而细胞胆固醇外排相关蛋白的降低，是源于细胞内胆固醇水平的下降，而非直接的抑制作用，因此不具有剂量依赖性。因此，本研究推断IC1通过抑制巨噬的胞吞作用，从而抑制泡沫细胞的形成。

动脉粥样硬化血管病变斑块的产生和发展，是由于血管壁细胞吞噬胆固醇脂并导致其在细胞内的堆积所致，在该过程中低密度脂蛋白受体家族（low density lipoprotein receptor superfamily，LDLRs）中的多种受体发挥了重要作用，其中LRP1尤其受到重视。作为一种内吞性受体，LRP1能识别多种配体并在体内将其清除。其清除过程为：LRP1首先与其配体结合形成复合物并被内吞入细胞形成内体，然后在溶酶体内被水解，LRP1则回到细胞膜循环利用。之前的研究发现LRP1是介导aggLDL进入细胞的重要途径，且不受细胞内脂质浓度的调节；同时临床实验发现，冠心病患者单核细胞可能高表达LRP1，因此LRP1被认为是动脉粥样硬化中泡沫细胞形成的重要因素之一，其本身可能起促进动脉粥样硬化进展的作用^[13]。综上所述，化合物IC1对LRP1的抑制作用使其可能成为潜在的抗As药物。

[参考文献]

[1]王竹， 高永翔. 动脉粥样硬化与巨噬细胞源性泡沫细胞的相关研究进展[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2015 （6）： 853.

[2]刘守钾， 杨智承， 刘苑， 等. 动脉粥样硬化中单核细胞招募与泡沫细胞形成[J]. 中国动脉硬化杂志， 2009 （11）： 957.

[3]张悦. 龙里冬青和猫儿刺的化学成分及生物活性研究[D]. 武汉：华中科技大学， 2011.

[4]孙乐， 张鑫瑶， 万文婷， 等. 山绿茶的研究进展[J]. 中国现代中药， 2015 （1）： 72.

[5]佘颜， 张国明， 蔺晓源， 等. 苦丁茶对动脉粥样硬化大鼠血管内皮功能的影响[J]. 中国中医急症， 2014， 23（2）： 220.

[6]Xie G B， Zheng J， Tu P F， et al. Triterpenesaponins from the leaves of Ilex pernyi[J]. Helv Chim Acta， 2008， 91（9）： 1630.

[7]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival： application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods， 1983， 65（1）： 55.

[8]Burger P C， Wagner D D. Platelet P-selectin facilitates atherosclerotic lesion development[J]. Blood， 2003， 101（7）： 2661.

[9]Zhu Y， Liao H， Xie X， et al. Oxidized LDL dowegulates ATP-binding cassette transporter-1 in human vascular endothelial cells via inhibiting liver X receptor （LXR）[J]. Cardiovasc Res， 2005， 68（3）： 425.

[10]Christopher K G， Joseph L W. Atherosclerosis： the road ahead[J]. Cell， 2001， 104（4）： 503.

[11]Llorente-Cortés V， Martínez-González J， Badimon L. LDL receptor-related protein mediates uptake of aggregated LDL in human vascular smooth muscle cells[J]. Arterioscl Throm Vasc Biol， 2000， 20（6）： 1572.

[12]Gough P J， Greaves D R， Suzuki H， et al. Analysis of macrophage scavenger receptor （SR-A） expression in human aortic atherosclerotic lesions[J]. Arterioscl Throm Vasc Biol， 1999， 19（3）： 461.

[13]Boucher P， Gotthardt M， Li W P， et al. LRP： role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis[J]. Science， 2003， 300（5617）：329.

[责任编辑 马超一]

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