猪皮肤撕脱伤ＣＤ１８的表达与组织继发性坏死的研究
[摘要]目的：研究猪皮肤撕脱伤组织中整合素CD18的表达及中性粒细胞的趋化，探讨CD18在皮肤撕脱伤组织继发性坏死中的作用。方法：复制猪皮肤撕脱伤模型，采用RT-PCR方法检测伤后不同时间撕脱组织中CD18mRNA的表达；用髓过氧化酶(MyeloperoxidaBe enzyme，MPO)法测定组织中中性粒细胞数量，研究伤后撕脱组织中中性粒细胞的趋化情况。结果： ①伤后撕脱组织中CD18mRNA的表达逐渐升高，12h达峰值，24h后有所下降，受伤2h后各时间点实验组CD18mRNA的表达明显高于对照组（P<0.05）。 ②MPO伤后2h开始升高，12h达峰值，24h无明显下降趋势， 受伤2h后实验组各时间点MPO活性明显高于对照组（P<0.01）。结论： 皮肤撕脱伤伤后早期组织中整合素CD18呈高表达，其变化与组织中中性粒细胞的趋化呈正相关，提示CD18在皮肤撕脱伤早期组织继发性坏死中可能发挥了重要作用。
[关键词]皮肤撕脱伤；CD18；中性粒细胞；髓过氧化酶
[中图分类号]R619.6[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2007）09-1175-03
The expression of CD18 and tissues secondary necrosis in skin avulsion injure of swine
Song Bao-qiang1,Guo Shu-zhong1,HU Ya-lan2,Han Yan1,LI Yu3
(1.Institute of Plastic Surgery of Chinese PLA,Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi"an 710032,Shaanxi,China; 2.Department of Plastic Surgery,260 Hospital,the Bethune Military Medical College,Shijiazhuang 050041,Hubei,China;3.Department of Pathology,the Fourth Military Medical University.)
Abstract: Objective To investigate the expression of CD18 and the tendency of neutrophil in avulsed skin tissues of swine, and to discuss the effect of CD18 on secondary tissues necrosis of skin avulsion injury. Methods The animal model of skin avulsion injury was replicated, and the expression of CD18mRNA in avulsed skin tissues was detected by RT-PCR method; and the amount of neutrophilic granulocyte in tissues was detected by MPO method in order to analyze the tendency of neutrophil of avulsed tissues after trauma.Results①The expression of CD18mRNA in avulsed tissues after trauma gradually increased, reached its peak value at the 12th hour, and then decreased slightly in the following 12 hours. The relative value of CD18mRNA of avulsed skin tissues in experiment group was markedly higher than that in control group at the different time after 2nd hour of trauma（P<0.05）. ②The activity of MPO in avulsed skin tissues in experiment group began to rise at the 2nd hour after trauma, and reached its peak value at 12th hour. No obvious decline occurred in the following 12 hours. The activity of MPO in experiment group was obviously higher than that in control group at the different time after 2nd hour of trauma（P<0.01）.ConclusionThe expression of CD18 in tissues is high during the early period of skin avulsion injury and its change is in positive correlation with the tendency of Neutrophil in tissues. It should be pointed out that CD18 may act an important role in secondary tissue necrosis of skin avulsion injury at the early stage.
Key words: skin avulsion injury; CD18; neutrophil; myeloperoxidase
皮肤撕脱伤是整形外科常见创伤，其组织继发性坏死机制的研究是该类损伤基础研究的重点。近些年的研究发现，粘附分子在皮瓣的缺血再灌注损伤中发挥着重要的作用，其中CD18所介导在中性粒细胞损伤在其中扮演了重要的角色[1-2]。由于皮肤撕脱伤伤后存在缺血再灌注的病理生理过程，因而CD18在撕脱伤中的作用也是我们关心的问题之一。本研究拟通过对受伤组织中CD18的表达及中性粒细胞趋化的研究，探讨粘附分子CD18在皮肤撕脱伤组织继发性坏死中的作用。
1材料和方法
1.1 实验动物及分组：选择检疫后的白色小猪作为实验动物，共14头，其中雌性6头，雄性8头，体重15～25kg，人工混合饲料喂养。将14头小猪随机分成实验组和对照组，每组7头。
1.2 皮肤撕脱伤模型的复制及标本的采集：实验组动物经3%戊巴比妥钠30mg/kg肌注麻醉后，猪后肢外侧预撕脱部位备皮，将其固定于撕脱伤模型机上，按文献[3]报道的参数复制皮肤撕脱伤。随即将遭受创伤的小猪固定于手术台上，常规消毒铺巾，用美蓝于猪后肢撕脱区域设计一12cm×4cm的蒂在近端的任意型皮瓣，沿设计线切开皮肤、皮下，于深筋膜下掀起皮瓣，随后再将其原位缝回。术后0、2、6、12、24h于皮瓣的中远1/3交界处采集组织标本。对照组动物不经模型机碾压，直接于猪后肢通过手术形成一12cm×4cm的蒂在近端的任意型皮瓣，术后0、2、6、12、24h于皮瓣中远1/3交界处采集组织标本。
1.3 组织中CD18mRNA的表达：采用RT-PCR 法检测组织标本中CD18mRNA的表达，用 Trizol 试剂（Gibco-BRL公司）分别提取实验组和对照组组织标本中的总 RNA，用随机引物将其反转录成 cDNA 后进行 PCR 扩增，并以β-Actin为内对照。其中扩增CD18基因的上游引物为5" TTTAgAAgAACAACCCgTgC 3"；下游引物为：5" TgTTgATgCTggACgTgCAC 3"；PCR 条件为：94℃30 s，55℃60 s，72℃60 s，30个循环。反转录按照试剂盒（Promega公司）提供的说明书进行，其中CD18的扩增片断为500bp，β-Actin的扩增片断为250bp, 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，用UVP凝胶成像系统进行检测，并用Labworks软件对各阳性条带的密度进行测定。利用PCR胶回收试剂盒（上海华舜生物技术公司）将PCR产物从凝胶上收回，进一步亚克隆至PMD18-T载体，经转化JM109感受态细胞、筛选、小量制备质粒DNA后，用Sanger双脱氧链终止法及测序试剂盒(Amer-sham)进行序列测定。
1.4 组织中MPO活性测定：取撕脱组织0.1g，加入0.5%溴代十六烷基三甲胺（Sigma公司）溶液2ml，用匀浆机（德国ART公司）匀浆。超声细胞粉碎仪（英国SANYO MSE公司），（10s、3次）粉碎细胞及亚细胞成分。0～4℃，40000g离心15min。取上清0.1ml加反应液2.9ml（磷酸邻联茴香胺16.7mg，50mmol/LPBS液10ml，蒸馏水90ml，加入30%过氧化氢，使最终浓度为0.0005%），分光光度计（HITACHI公司）460μm波长下立即进行2min扫描。以第30s至90s 1min时间内吸光度(OD值)的变化代表酶活力的改变。根据下列公式计算MPO活性单位（25°C下，每分钟分解1μmolH2O2的MPO的量为1个MPO活性单位)，以反映组织中中性粒细胞的浸润数量。MPO活性单位（×103U）/kg=（ΔA460/min）÷（11.3×所加组织量/L反应液）。
1.5 统计学处理：实验结果均以均数±标准差表示，采用SPSS10.0统计软件t检验对实验数据进行统计分析。
2结果
2.1组织中CD18mRNA的表达：凝胶电泳结果显示实验组与对照组各时间点均有阳性条带，PCR产物从凝胶上回收扩增后，序列测定显示为整合素CD18的cDNA。利用Labworks软件对各阳性条带进行分析，结果显示：两组各阳性条带的灰度值存在差异，而内参照β-Actin的表达两组间没有差异(图1)，两组CD18 mRNA的表达均随时间推移而逐渐升高，至12h达峰值，此后略有下降，撕脱2h后实验组各时间点CD18 mRNA的表达明显高于对照组（图2） (P<0.05)。
2.2组织中MPO活性的变化 实验组MPO活性于伤后逐渐升高，12h达峰值，对照组术后逐渐升高，6h达峰值，受伤2h后实验组各时间点MPO活性数值明显高于对照组（P<0.01）。（表1）
3讨论
皮肤撕脱伤是整形外科常见创伤，临床救治中我们常会见到受伤的组织早期血运良好，但原位缝回后，随着时间的延长，会逐渐出现部分组织的坏死，即组织的继发性坏死。由于引发坏死的机制尚不甚清楚，目前缺乏有效的应对措施，也直接影响了皮肤撕脱伤的临床救治效果，因而探索、研究组织继发性坏死的机制，对于预防组织坏死、提高皮肤撕脱伤临床救治效果有着重要的意义。为此我们已进行了大量的相关研究，并取得了一定的进展，发现撕脱组织中自由基增加、钙离子超负荷、TXA2/PGI2、选择素等的变化在组织继发性坏死中扮演着重要角色[4-5]。
随着研究的不断深入，我们发现，撕脱组织在受伤的瞬间，来自基底及周围的血液供应被即时阻断，血供来源仅依靠与本体相连的蒂部。由于血供方式的突然改变，大部分撕脱组织处于缺血状态。随着伤后时间的推移，组织血循环得以重新分布，处于缺血状态的受伤组织再次得到血流灌注。但组织学研究发现，随着时间的延长，受伤组织中出现大量的炎细胞浸润，并有大量微血栓形成，最终导致了部分组织的坏死。这些继发性组织病理改变是否与早期撕脱组织的再灌注损伤有关是值得我们进一步关注的问题。已有的研究显示，粘附分子在皮瓣的缺血再灌注损伤中发挥着重要作用[1]，其中整合素CD18所介导的中性粒细胞损伤在其中扮演着重要角色，它与皮肤撕脱伤组织继发性坏死的关系是本研究所关注的重点。
中性粒细胞含有MPO，每个细胞所含酶的量是一定的，约占细胞干重的5%，该酶具有还原过氧化氢的能力，利用此特点，通过分析组织中MPO的活力，就可以反应组织中中性粒细胞的数量变化[6]。我们的研究也利用了中性粒细胞的这一特点，对受伤组织中中性粒细胞数量随时间的变化进行了检测。结果显示，撕脱伤后随着时间的延长，MPO活性明显增高，提示受伤组织中有大量的中性粒细胞聚集，这与组织学研究的结果完全一致[3]。MPO动态变化显示，受伤组织中中性粒细胞的趋化在伤后12h达到了高峰，24h后仍无明显下降趋势。已有研究表明：中性粒细胞在组织和脏器的大量聚集和过度活化会对宿主产生破坏作用，释放大量毒性氧自由基和蛋白水解酶，导致血管通透性增加、组织水肿等一系列病理变化[7-9]；同时被激活的中性粒细胞粘附于血管内皮，引起毛细血管前括约肌和后微静脉损伤，流通受阻的中性粒细胞发生堆积，阻塞毛细血管，加重缺血损伤，最终导致局部组织的坏死。根据MPO的检测结果，我们推测，皮肤撕脱伤早期，中性粒细胞向受伤组织的大量聚集可能是引发组织继发性坏死的重要原因之一。
有关组织再灌注损伤的进一步研究显示，中性粒细胞对组织的损害作用呈粘附依赖性，即依赖于中性粒细胞与内皮细胞之间的粘附，而这种粘附作用主要是通过中性粒细胞表面粘附蛋白CD18介导完成。通常情况下，中性粒细胞与内皮细胞间亲和力较弱，相互间很少发生粘附，即使粘附也会很快分开，可能是与正常情况下粘附分子表达较弱有关。特定条件下，如缺氧、创伤等因素的刺激，粘附分子的表达可能会增强，甚至过度表达[10]，这种高表达为粒细胞与内皮细胞间的粘附提供了有力的支持。我们针对皮肤撕脱伤撕脱组织CD18的检测显示，撕脱伤后，受伤组织中CD18mRNA表达明显增强，其表达随着时间的延长与中性粒细胞的趋化呈正相关，提示这种高表达与组织中中性粒细胞的趋化、粘附密切相关。在此过程中由于中性粒细胞和内皮细胞的粘附所导致的粒细胞活化和内皮细胞的损伤引发了一系列的病理生理改变，包括毛细血管通透性增大、组织水肿及大量微血栓形成等，最终导致组织的坏死[11-12]。
本研究结果提示：整合素CD18在皮肤撕脱伤早期呈高表达，这种高表达CD18可能在组织继发性坏死中发挥着重要作用。在创伤早期，特别是伤后12h内，有针对性地进行CD18的拮抗治疗，将有效抑制中性粒细胞过度趋化、粘附所造成的组织坏死，对皮肤撕脱伤组织继发性坏死起到积极的预防作用。
[参考文献]
[1]Hong JP, Kwon H, Chung YK, et al. The effect of hyperbaric oxygen on ischemia-reperfusion injury: an experimental study in a rat musculocutaneous flap[J]. Ann Plast Surg, 2003, 51(5):478-487.
[2]Demirseren ME, Sarici M, Gokrem S, et al.Protective effects of monoclonal antibody to intercellular adhesion molecule-1 in venous ischemia-reperfusion injury: experimental study in rats[J]. J Reconstr Microsurg, 2007,23(1):41-44.
[3]李向东,鲁开化, 郭树忠,等. 皮肤撕脱伤实验动物模型建立与实验的报告[J]. 中国美容医学, 2001, 10(2):103-104.
[4]季红星, 郭树忠, 鲁开化. 可溶性E-选择素分子在猪皮肤撕脱伤血浆中的表达[J]. 中国美容医学, 2001,10(4):289-290.
[5]李向东, 鲁开化, 郭树忠, 等. 药物局部治疗对猪皮肤撕脱伤后TXA2/PGI2变化的影响[J].第四军医大学学报, 1999, 20(11):929-931.
[6]Lau D, Mollnau H, Eiserich JP, et al. Myeloperoxidase mediates neutrophil activation by association with CD11b/CD18 integrins[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(2):431-436.
[7]Edens HA, Parkos CA. Neutrophil transendothelial migration and alteration in vascular permeability: focus on neutrophil-derived azurocidin[J]. Curr Opin Hematol, 2003,10(1):25-30.
[8]Harmon D, Lan W, Shorten G, et al. The effect of aprotinin on hypoxia-reoxygenation-induced changes in neutrophil and endothelial function[J]. Eur J Anaesthesiol, 2004,21(12):973-979.
[9]Simon SI, Green CE. Molecular mechanics and dynamics of leukocyte recruitment during inflammation[J]. Annu Rev Biomed Eng, 2005,7:151-185.
[10]Mayadas TN, Cullere X. Neutrophil beta2 integrins: moderators of life or death decisions[J]. Trends Immunol, 2005, 26(7):388-395.
[11]Kakkar AK, Lefer DJ. Leukocyte and endothelial adhesion molecule studies in knockout mice[J].Curr Opin Pharmacol, 2004, 4(2):154-158.
[12]Ishihara K, Yamaguchi Y, Uchino S, et al. ICAM-1 signal transduction in cells stimulated with neutrophil elastase[J]. Dig Dis Sci, 2006, 51(11):2102-2112.
[收稿日期]2007-05-14 [修回日期]2007-08-11
编辑/张惠娟
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”