全反式维甲酸诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2表达碱性磷酸酶
【摘要】 目的 分析全反式维甲酸对小鼠间充质干细胞C3H10T1/2表达碱性磷酸酶的影响。方法 全反式维甲酸(10-6M)、维甲酸核受体RAR的激动剂Ch55与MAPK信号通路的阻滞剂处理C3H10T1/2细胞,钙钴染色检测碱性磷酸酶活性,定量RT-PCR方法检测量效关系以及时相分布;采用萤光素酶报告基因检测碱性磷酸酶的启动子是否接受维甲酸的调控。结果 维甲酸处理C3H10T1/2细胞24 h即能够明显上调ALP的活性,具有明显的剂量依赖特性,与RAR有关,无MAPK信号通路的参与,在其转录起始位点上游-512bp的范围内检测到核受体RAR的调控位点。结论 维甲酸能够通过核受体RAR直接上调碱性磷酸酶的转录水平。
【关键词】 全反式维甲酸;间充质干细胞;碱性磷酸酶;启动子
All Trans Retinoic Acid Upregulates Alkaline Phosphatase in Mouse Mesenchymal Stem Cell C3H10T1/2
【Abstract】 Objective To investigate the effects of all trans retinoic acid (ATRA) on the transcription level of mouse embryonic mesenchymal stem cell C3H10T1/2.Methods C3H10T1/2 were treated with all trans retinoic acid(10-6M), retinoic acid receptor ( RAR) agonist Ch55 and MAPK signal pathway inhibitor, alkaline phosphatase(ALP)activity were monitored by ALP staining, ALP transcription level were analyzed by quantitative RT-PCR; Systemic promoter analysis based on Luciferase reporter assay was undertaken to search for ALP promoter region to which RAR binds.Results ATRA stimulates ALP activity significantly in 24 h, which is dosage dependent and relevant to RAR, and the potential RAR binding site exists in the -512bp region of ALP promoter.Conclusion ATRAupregulates ALP expression in C3H10T1/2 cells mediated by RAR.
【Key words】 All trans retinoic acid; Mesenchymal stem cell; Alkaline phosphatase; Promoter
全反式维甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)类物质是维生素A的衍生物,具有广泛的生物学活性。正常情况下,由于软骨组织中大量分布各种RA的受体,RA对于软骨分
化、骨发育甚至是骨的重建过程都有十分重要的作用;在病理情况下,RA摄入与代谢的不平衡都可能导致软骨与骨组织的分化、发育异常甚至是畸形,改变骨与软骨组织的正常结构,或形成骨质疏松。
作者单位:510080广东药学院附属第一医院骨科(胡伶平 董群伟);暨南大学生物工程研究所(孙奋勇)
维甲酸包括多种同分异构体,其中最重要的是13-顺式维甲酸(13-cRA)、全反式维甲酸(ATRA)和9-顺式维甲酸(9-cRA)。维甲酸由胃肠道吸收后经氧化形成ATRA,通过单纯弥散进入细胞。ATRA进入细胞核内,与核维甲酸受体(retinoicacidreceptor,RAR)或维甲酸类X受体(retinoidX receptor,RXR)结合。RAR有三种亚型,RARα、RARβ、RARγ,可与9-cRA和ATRA结合,而RXR的三种亚型就只能与9-cRA结合。RAR或RXR进一步结合于维甲酸靶基因的维甲酸反应元件(RARE),从而调控基因的转录和表达[1]。
碱性磷酸酶(alkaline phosphotase,ALP)是成骨分化的早期标志,是成骨细胞的一种细胞外酶,为糖蛋白,该酶能够增加无机磷酸盐的局部浓度,拮抗骨矿晶体生长的局部抑制因子,增加局部磷酸根的浓度,参与细胞间磷酸根的转运[2]。本文着重探讨了ATRA对成骨相关细胞ALP表达的影响,及其分子机制的研究。
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM培养基(Invitrogen),胎牛血清(Hyclone),逆转录酶Superscript Ⅲ(Invitrogen),定量PCR用多聚酶SYBR Premix Ex Taq(Takara),ALP启动子重组pGL3载体由课题组以前构建,引物合成由上海生工完成。
1.2 方法 细胞培养及处理:所有细胞均培养于DMEM培养基,10%胎牛血清,5% CO.2,37℃培养,给药前0.5%胎牛血清饥饿24 h,按一定剂量加入各种处理试剂后诱导一定时间,染色或抽提total RNA备用。
1.3 碱性磷酸酶染色 95%乙醇固定10 min,晾干,底液孵育,37℃,4 h,1%硝酸钴作用2 min,冲洗1~2 min,1%硫酸铵作用1 min,水洗5 min,晾干后镜下观察。
1.4 定量RT-PCR 细胞接种于6孔板中,用PBS清洗细胞,Trizol抽提RNA,Superscript Ⅲ进行逆转录,42℃反应30 min,逆转录引物采用Oligo dT与Random Hexamer。Realtime定量PCR反应体系:2×PCR premix 10 μl, Primers 0.8 μl, cDNA 1 μl,H.2O补平体积20 μl;反应条件: 95℃ 10 min, 95℃ 15 s,60℃ 60 s,读板,共50 个循环;融解曲线分析:温度55℃-95℃, 读1次/min。每个样设置3个复孔。ALP引物:5′>CCGATGGCACACCTGCTT< 3′,5′>GAGGCATACGCCATCACATG< 3′;β-actin 引物:5′>CCTGAGGCTCTTTTCCAGCC< 3′, 5′>AGGTCTTTACGGATGTCAACGT< 3′。
1.5 细胞转染 将2 μgpGL3 系列重组质粒与0.1 μg pRL-CMV 对照质粒在Lipofectinamine2000 介导下共转染细胞,每种重组子平行导入3孔细胞,并同时用ATRA(10-6M)继续培养24 h后收集细胞,每组实验重复2次。Luciferase检测按Promega双报告检测试剂盒提供的方法操作。
2 结果
2.1 ATRA诱导成骨相关细胞表达ALP 分别用ATRA(10-6M)、BMP2(20 μg/ml)及对照处理成骨相关细胞C3H10T1/2、MC3T3、C2C12一定时间,钙钴法染色检测ALP活性,发现ATRA单独处理C3H10T1/2细胞24 h即能够明显上调ALP的活性,而BMP2的活性相比较弱(图1),ATRA对MC3T3、C2C12的作用不明显(结果未给出)。
图1 ATRA诱导C3H10T1/2细胞中ALP的活性显著上调(钙钴染色,100×)
2.2 ATRA诱导ALP表达的量效关系与动力学特征
采用定量RT-PCR的方法检测C3H10T1/2细胞中ALP表达的情况,发现10-4M至10-8M ATRA诱导24 h时都有上调ALP转录的作用,但较高ATRA浓度时反而导致增加趋势有所下降,可能是ATRA浓度较大时有一定的毒性作用。从时间分布来看,诱导1 h,ALP转录即开始迅速增加,12 h基本达到峰值,上调16倍左右,以后转录水平不再增加,维持较高的水平,而C2C12、MC3T3-E1细胞中检测不到ALP的变化(图2A)。由于ALP上调开始较早,我们推测可能是RA通路的直接作用,使用蛋白合成抑制剂CHX首先处理C3H10T1/2 30 min后,10-6M ATRA处理,发现ALP的表达上调仍然十分明显(图2B),表明ATRA上调ALP的作用是不依赖于蛋白质合成的直接作用。
图2 ATRA诱导ALP转录的量效关系与时间动力学变化
注:A. 定量RT-PCR检测不同浓度ATRA诱导C3H10T1/2、MC3T3-E1、C2C12细胞中ALP的转录情况(n=3);B. 定量RT-PCR检测ATRA上调ALP表达的时间动力学变化以及CHX对ATRA上调ALP转录水平的影响 (n=3)
2.3 ATRA上调ALP的作用与信号通路的关系
由于RA的主要信号途径是核受体的经典基因组途径,同时考虑到ATRA不会结合RXR型受体,因此我们采用RAR受体通用激动剂Ch55处理C3H10T1/2细胞,发现单独使用Ch55也能够明显上调ALP的转录。另外,近年来的研究表明ATRA能够激活一些非基因组的快速磷酸化途径,主要是MAPK通路,我们运用JNK阻滞剂SB600125、ERK阻滞剂PD98059、p38阻滞剂SB203580与ATRA共处理C3H10T1/2细胞,发现ALP的转录上调趋势未受影响,因此我们认为ATRA上调ALP的作用由RAR直接介导,与MAPK的快速磷酸化途径无关(图3)。
图3ATRA上调ALP转录与RA信号通路的关系
注:1. 对照;2. Ch55(RAR激动剂);3. ATRA+ SB600125(JNK阻滞剂);4. ATRA+ PD98059(ERK阻滞剂);5. ATRA + SB203580(p38阻滞剂)
2.4 在启动子水平寻找RAR的作用位点
考虑到结合了ATRA的RAR极有可能直接结合在ALP启动子的某一个区域,我们分段克隆了ALP转录起始位点上游2kb范围内的启动子序列,将其连接到启动子报告载体pGL3-basic中,转染C3H10T1/2细胞后,ATRA处理24 h,化学发光检测仪检测luciferase的表达水平,结果发现-512bp的启动子片断活性较对照上调3倍左右(p<0.05),因此我们认为该片断内存在潜在的RAR调控位点(图4)。
图4 Luciferase报告基因筛查ALP启动子上潜在的RAR调控区域 (n=3)
3 讨论
我们首先分析了三种成骨相关细胞中ATRA对碱性磷酸酶的调控作用,其中C2C12是成肌细胞,在BMP2的诱导下能够横向分化为成骨细胞,MC3T3是成骨细胞,C3H10T1/2是小鼠胚胎间充质干细胞,二者都可以被BMP2诱导成为成熟的成骨细胞,我们只在C3H10T1/2细胞中检测到ATRA对ALP的上调作用,可能是因为还必须具备其他的调控因素的原因。
有趣的是,虽然BMP2是经典的成骨诱导因子,但ATRA对ALP表达的作用比BMP2的速度快而且作用强,可能与RA信号通路的特点有关。核受体RAR与配体ATRA结合后直接进入细胞核,与ALP启动子相结合,发挥转录因子的作用促进ALP的转录,由于中间环节少,因此作用较快,本研究中用蛋白合成抑制剂CHX干扰细胞内的蛋白质合成,发现对ATRA的作用几乎没有影响,充分说明ATRA结合RAR后直接激活ALP启动子,1 h就产生明显作用。相反,BMP2的促成骨作用虽然持久而且显著,但由于需要通过多种衔接蛋白如Smad的相互作用才能把信息传递到核内,更重要的是虽然Smad蛋白复合体入核后也能发挥转录因子的作用,但根据 Kim 等人的报道[3],Smad蛋白复合体并不直接作用于ALP启动子,而是首先上调成骨转录因子Dlx5的表达,并通过Dlx5激活ALP启动子,因此作用比ATRA迟缓。此外,由于BMP2信号通路存在大量的抑制因素[5,6],例如内源性分泌表达的负显性受体BAMBI,受体竞争性抑制剂Noggin、Chordin、Dan, Smad分子抑制蛋白Smad6、Smad7、Smurf,能够在多个环节抑制通路的过度激活,起到负反馈的调节作用,因此BMP2诱导ALP的能力不如ATRA。
RA信号途径有二:①经典的基因组途径,结合了ATRA的RAR 进一步结合于靶基因的RARE,从而调控基因的转录和表达;②非经典的快速磷酸化途径,越来越多的证据表明还存在不依赖于基因组的快速磷酸化通道,主要与MAPK途径有关[7-9]。因此我们首先分析了RAR激动剂Ch55是否能够替代ATRA的作用,结果发现单独使用Ch55也能够明显上调ALP的转录。相反MAPK信号通路的阻滞剂却对ALP的上调没有任何影响。
最后我们希望能在ALP的启动子上找到RAR直接作用的证据,选取了转录起始位点上游2kb的范围作为主要的搜索区域,结果发现-512bp片断的活性明显受到RA的上调,因此认为该端区域内为RAR潜在的调控位点,为下一步的工作打下基础。
参 考 文 献
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