心肌营养素-1对抗NMDA受体脑炎致海马神经元损伤的保护作用

材料与方法

1.1 实验动物 选择刚出生的SD大鼠，进行原代神经元细胞培养。

1.2 方法

1.2.1 原代神经元培养 选择刚出生的SD大鼠，用眼科镊取出海马，D-Hanks液清洗后，剪成1 mm3左右的小块，在37 ℃温度下用0.25%胰蛋白酶消化组织小块后，调节细胞悬液浓度为1×106/mL，接种于经0.01%多聚赖氨酸预处理的细胞培养瓶中。神经元细胞培养9 d后，经过NF-200免疫细胞组织化学法鉴定，神经元占培养细胞的90%以上。

1.2.2 建立抗NMDA受体脑炎诱导的神经元损伤模型 当神经元细胞培养至第9天，随机选取60个标本为实验1组，15个样本为对照1组，将实验1组均分为4个小组，分别加入不同浓度谷氨酸（100、200、300、400 μmol/L），对照1组不加任何药品处理，实验1组中不同浓度的谷氨酸与神经元细胞作用15 min后更换新鲜培养液，24 h后进行台盼蓝染色和TUNEL细胞凋亡检测。（1）台盼蓝染色检测细胞存活率：神经元细胞经台盼蓝染色后，随机计数15个视野中蓝染神经元数，死亡细胞被染成蓝色，未着色的细胞为存活细胞。神经元存活率=神经元存活数/细胞总数×100%。（2）TUNEL检测细胞凋亡率：神经元细胞经TUNEL检测，随机计数15个视野中深棕色神经元数，凋亡细胞被染成深棕色，未着色的细胞为存活细胞。神经元凋亡率=神经元凋亡数/细胞总数×100%。

1.2.3 CT-1对抗NMDA受体脑炎诱导神经元损伤的保护作用 另随机选取原代神经元细胞45个标本，将其均分为实验组﹑对照组和正常组，各15个标本。实验组在加谷氨酸前1天加入CT-1（10 ng/mL），對照组中加入相同剂量缓冲液，正常组不做处理。当神经元细胞培养至第9天，将低浓度谷氨酸（100 μmol/L）加入实验组和对照组中，15 min后换回正常细胞培养液，正常组不加入谷氨酸。继续培养细胞至1﹑2、3 d进行细胞存活率、凋亡率和细胞凋亡基因Caspase-3表达水平。Caspase-3基因表达检测：采用免疫组化方法检测Caspase-3基因表达，随机计数15个视野中阳性神经元数和总神经元数，神经元中有棕色着色者为阳性神经元，Caspase-3基因阳性表达率=阳性神经元数/神经元总数×100%。

1.3 统计学处理 使用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代神经元培养和鉴定 神经元细胞接种细胞培养瓶后，可见细胞为悬浮在培养液中的小圆形细胞，边界清楚，细胞密度很高;1 d后在培养瓶壁上可见大多数细胞基本贴壁，少数细胞可见轴突生长，轴突长度约占细胞体的一半;2 d后大多数细胞有轴突生长，长度约为胞体的2～3倍;3 d后神经元细胞胞体变大，轴突长度增长不明显;第4～5天可见许多细胞碎片，为崩解的神经胶质细胞;培养第8天，轴突逐渐增长，彼此相互连接，形成网状，见图1;细胞培养第9天，免疫组织化学鉴定神经元，神经元细胞及其轴突被染成棕色，棕色阳性细胞占全部细胞的90%以上，见图2。

2.2 抗NMDA受体脑炎诱导的神经元损伤模型分析 台盼蓝染色发现，不同浓度的谷氨酸作用于神经元细胞6 h后，可见部分细胞胞体肿胀，细胞轴突变短，1 d后部分肿胀细胞裂解;TUNEL染色发现，不同浓度的谷氨酸作用于神经元细胞1 d后，神经元细胞体积变小，细胞核固缩;各种浓度的谷氨酸均能诱导神经元凋亡，实验1组不同浓度谷氨酸组细胞存活率均低于对照1组，凋亡率均高于对照1组，差异均有统计学意义（P<0.05），且随着谷氨酸浓度逐渐升高，神经元细胞的存活率逐渐下降，细胞凋亡率逐渐上升，差异均有统计学意义（P<0.05），其中谷氨酸浓度为100﹑200 μmol/L时，细胞凋亡率随着谷氨酸浓度的升高而升高，而浓度为200﹑300﹑400 μmol/L时，细胞凋亡率随着谷氨酸浓度的升高而下降，见表1和图3、4。

2.3 CT-1对神经元的保护作用

2.3.1 细胞凋亡率、存活率比较 当神经元细胞培养至第9天，加入100 μmol/L谷氨酸诱导凋亡后，TUNE检测显示：第1、2、3天，正常组细胞凋亡率均低于实验组和对照组，且实验组低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;台盼蓝染色显示：第1、2、3天，正常组细胞存活率均高于实验组和对照组，且实验组均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2、图5～9。

2.3.2 Caspase-3基因表达情况分析 细胞免疫组化技术检测Caspase-3蛋白在神经元细胞中的表达情况，Caspase-3阳性细胞可见神经元胞浆和轴突着色;凋亡后第1、2、3天，正常组Caspase-3阳性细胞率均低于实验组和对照组，且实验组均低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3和图10、11。

3 讨论

抗NMDA受体脑炎是一种起病时临床表现不典型，易被临床工作者忽视的一种神经系统疾病，主要累及人体大脑边缘系统，典型临床表现以精神异常与癫痫发作为特征，其中大多数病人由肿瘤、感染等引起[6-12]。抗NMDA受体脑炎的发病机制迄今尚未完全阐明，目前大部分学者认为该病是抗NMDA抗体介导的免疫损伤所致，NMDA受体是一种谷氨酸离子型受体，由多种亚基组成的异四聚体，属电压门控通道，大量存在于大脑神经细胞中，其中主要分布在大脑海马区等边缘系统，功能主要是调节突触传递及促发突触重塑，异常激活常导致惊厥发作、精神异常等临床表现[13-17]。

本研究在神经元细胞培养至第10天，当神经元发育成熟，细胞状态良好时，用不同浓度的谷氨酸作用于神经元细胞，检测细胞凋亡率，结果显示，各种浓度的谷氨酸均能诱导神经元凋亡，实验1组不同浓度谷氨酸组细胞凋亡率均高于对照1组，且随着谷氨酸浓度逐渐升高，神经元细胞凋亡率逐渐上升，差异均有统计学意义（P<0.05），其中谷氨酸浓度为100﹑200 μmol/L时，细胞凋亡率随着谷氨酸浓度的升高而升高，而浓度为200﹑300﹑400 μmol/L时，细胞凋亡率随着谷氨酸浓度的升高而下降。而且本研究结果显示，实验1组不同浓度谷氨酸组细胞存活率均低于对照1组，且随着谷氨酸浓度逐渐升高，神经元细胞的存活率逐渐下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。由于谷氨酸浓度为100﹑200 μmol/L时，细胞凋亡率高而细胞死亡率并不高，提示100﹑200 μmol/L的谷氨酸为诱导神经元凋亡的最佳浓度。在证实了低浓度的谷氨酸可引起神经元凋亡之后，笔者在使用谷氨酸诱导神经元凋亡的前1天，在实验组神经元细胞中加入CT-1，然后采用TUNEL检测和台盼蓝染色等方法来评价CT-1对神经元的保护作用，结果显示，第1、2、3天，正常组细胞凋亡率均低于实验组和对照组，且实验组低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），正常组细胞存活率均高于实验组和对照组，且实验组均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），说明加入了CT-1的实验组细胞存活率明显高于对照组，而细胞凋亡率却明显低于对照组，提示CT-1对抗NMDA受体脑炎导致的神经元损伤具有抑制作用，对神经元具有保护作用。而其对神经元的保护作用，可能主要是通过抑制凋亡的途径来实现的。

Caspase家族在介導细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，其在凋亡信号传导的许多途径中发挥作用。Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡[18-20]。在抗NMDA受体脑炎导致的神经元凋亡的机制中，为探究有无Caspase-3的参与，而CT-1对其表达有无抑制作用，笔者作了Caspase-3免疫组化，结果显示：凋亡后第1、2、3天，正常组Caspase-3阳性细胞率均低于实验组和对照组（P<0.05），提示谷氨酸损伤使Caspase-3蛋白表达增加，Caspase-3参与了抗NMDA受体脑炎导致的神经元凋亡的机制;实验组Caspase-3蛋白表达低于对照组（P<0.05），提示CT-1可抑制Caspase-3蛋白表达，因此其抑制凋亡的作用可能与抑制Caspase-3蛋白表达有关。

综上所述，本研究提示低浓度谷氨酸可作为抗NMDA受体脑炎导致的神经元凋亡的良好模型，CT-1对抗NMDA受体脑炎导致的神经元损伤有保护作用，可能是通过促使凋亡基因Caspase-3表达下调，减少细胞凋亡发生，从而对抗NMDA受体脑炎诱导的神经元损伤起到保护作用。

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（收稿日期：2018-08-13） （本文編辑：董悦）

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