大鼠肺缺血再灌注损伤模型中TLR4信号通路介导HIF—1α的变化及其意义
[摘要] 目的 探討大鼠肺缺血再灌注损伤（IRI）模型中Toll样受体4（TLR4）信号通路介导缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的变化及其意义。 方法 选取48只健康雄性SD大鼠，采用随机数字表法分为假手术组、IRI模型组、TLR4激活组（脂多糖干预）、TLR4抑制组（TAK-242干预），每组各12只大鼠。造模前3周时，IRI模型组和假手术组静脉注射生理盐水，TLR4激活组静脉注射脂多糖，TLR4抑制组静脉注射TAK-242，每周1次，连续3周。IRI模型组、TLR4激活组和TLR4抑制组均于末次注射30 min后建立肺缺血再灌注损伤模型。假手术组除不阻断肺门外，其他操作方法同前。再灌注损伤后3 h采用逆转录聚合酶联反应（RT-PCR）检测各组大鼠肺组织中Toll样受体4（TLR4）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）mRNA表达，采用免疫印迹法（Western-blot）检测各组大鼠肺组织中TLR4、HIF-1α、TNF-α和IL-6蛋白表达水平。 结果 肺湿重/干重值IRI模型组高于假手术组（P < 0.05），TLR4激活组高于IRI模型组（P < 0.05），TLR4抑制组低于IRI模型组（P < 0.05）；肺组织中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达水平IRI模型组高于假手术组（P < 0.05），TLR4激活组高于IRI模型组（P < 0.05），TLR4抑制组低于IRI模型组（P < 0.05）。 结论 大鼠肺IRI后，肺组织中TLR4信号通路介導HIF-1α的水平显著升高，会增加对肺组织的炎症损伤程度。
[关键词] 肺缺血再灌注损伤；Toll样受体4；缺氧诱导因子-1α
[中图分类号] R563 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（c）-0018-05
[Abstract] Objective To investigate the changes and significance of hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α） mediated by Toll like receptor 4 （TLR4） signal pathway in the model of lung ischemia reperfusion injury （IRI） rats. Methods A total of 48 healthy male SD rats were selected and randomly divided into sham operation group， IRI model group， TLR4 activation group （LPS intervention） and TLR4 inhibition group （TAK-242 intervention） with 12 rats in each group. 3 weeks before model， IRI model group and sham operation group were injected with saline， TLR4 activation group was injected with lipopolysaccharide， TLR4 inhibition group was injected with TAK-242， once a week for three weeks. IRI model group， TLR4 activation group and TLR4 inhibition group were established a model of lung ischemia-reperfusion injury after last injection 30 minutes， sham operation group was treated same as the other groups except for not block the lung door. 3 hours after reperfusion injury， TLR4， HIF-1α， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） mRNA expression of lung tissue were tested by reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR）. TLR4， HIF-1α， TNF-α and IL-6 protein expression of lung tissue were tested by Western-blot. Results The lung wet weight/dry weight ratio of the IRI model group was higher than that of the sham operation group （P < 0.05）， the TLR4 activation group was higher than that of the model group （P < 0.05）， and the TLR4 inhibition group was lower than that of the model group （P < 0.05）. The mRNA and protein expression levels of TLR4， HIF-1α， TNF-α， IL-6 in the lung tissues of IRI model group were higher than those of the sham operation group （P < 0.05）， the TLR4 activation were higher than those of the model group （P < 0.05）， and the TLR4 inhibition group were lower than those of the model group （P < 0.05）. Conclusion The TLR4 signal pathway in the lung tissue mediates the HIF-1α expression increased significantly after lung ischemia-reperfusion injury in rats， and increases the degree of inflammatory damage to the lung tissue.
[Key words] Ischemia reperfusion injury of lung； Toll like receptor 4； Hypoxia inducible factor-1α
肺缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）是临床心肺术后较为常见的并发症之一，其可诱发一系列复杂的级联反应并导致肺损伤，严重影响患者的预后效果[1-3]。研究表明，IRI的发生和发展是一个复杂的病理过程，涉及炎性反应、氧化应激反应、自由基产生、促炎介质释放等过程[4]。而局部炎性反应又可诱发全身性炎性反应甚至是器官衰竭的发生，最终可导致死亡[5-8]。Toll样受体4（TLR4）信号通路被认为是炎性反应的重要信号因子，而缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是缺氧的信号因子之一，且二者之间具有相互调控机制，可进一步导致促炎性反应的发生，进而参与IRI的发生和发展[9]。为此，本研究探讨分析了大鼠肺IRI模型中TLR4信号通路介导HIF-1α的变化及意义，为临床上寻求新的治疗靶点提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选取48只健康雄性SD大鼠，均为SPF级，4～6周龄，体重250～300 g，平均（278.9±10.3）g，购买于新疆医科大学动物实验中心（动物合格证号：XJYKDX-20160317002），喂养于光照12 h、相对湿度45%～60%、温度23～25℃的实验室中。
1.2 药品、仪器
TAK-242、戊巴比妥钠、脂多糖、辣根过氧化物酶（HRP）均购自美国Sigma公司；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、RT-PCR试剂盒均购自美国Epitomics公司；单克隆兔抗TLR4、单克隆兔抗HIF-1α、单克隆兔抗TNF-α、单克隆兔抗IL-6均购自美国Epitomics公司；TLR4、HIF-1α、TNF-α和IL-6引物均购自上海生工生物工程有限公司。
动物呼吸机购自北京众实迪创科技公司，电泳槽购自美国Bio-Rad公司，RT-PCR仪购自美国应用生物系统公司，显微镜购自日本奥林巴斯公司。
1.3 分组与造模
将48只大鼠随机分成四组，即假手术组、IRI模型组、TLR4激活组和TLR4抑制组，每组各12只。其中，IRI模型组和假手术组于造模前3周静脉注射2 mL生理盐水，TLR4激活組于造模前3周静脉注射脂多糖（1.50 mg溶于2 mL生理盐水），TLR4抑制组于造模前3周静脉注射TLR4特异性抑制剂TAK-242（10 mg/kg溶于2 mL DMSO）进行干预，每周1次，连续3周。IRI模型组、TLR4激活组和TLR4抑制组均于末次注射30 min后建立肺缺血再灌注损伤模型，方法如下：大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠（60 mg/kg）麻醉，同时皮下注射肝素1000 U/kg，经口气管插管后接动物呼吸机，通气频率为70次/min，潮气量为10 mL/kg。在大鼠左侧第五肋间做长约3 cm的切口，切开胸廓后暴露左肺门，待大鼠吸气时完全阻断左肺门，45 min后恢复血流灌注，3 h时完整切取左肺。假手术组除不阻断肺门外，其他操作方法同前。
1.4 观察指标及检测方法
1.4.1 肺组织湿重/干重值检测 取部分左肺组织称量湿重，随后将其置于65℃烤箱中72 h，称量干重后计算左肺湿重与干重比值。
1.4.2 RT-PCR检测 取部分肺组织采用RNA提取试剂盒提取总RNA，利用逆转录试剂盒逆转录为DNA，在聚合酶的作用下进行扩增。引物如下：TLR4上游：GTTCATCTGCTTTCTGCTG，下游：TGATTCTGCCTGA-TGTTGC；HIF-1α上游：GTTTACTAAAGGACAAGTCACC，下游：TTCTGTTTGTTGAAGCAG；IL-6上游：ACTGCCTTCCCTACTTCACA，下游：TCGCTGTTCATACAATCAGA；TNF-α上游：AATCAGCCTCCCTCAT-CAGTT；下游：CCACTTGGTGGTTTGCTACGA；β-actin上游：GCCATGTACGTAGCCATCCA，下游：GAACCGCT-CATTGCCGATAG。扩增条件如下：95℃ 10 min，然后以95℃ 15 s、60℃ 60 s为1个循环，共进行40个循环。具体检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。电泳后得到目的条带的光密度值与β-actin光密度值进行比较，最终得出TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平。
1.4.3 Western-blot检测 取大鼠肺组织制备蛋白样，并取约75 μg以10%十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，分离后转移至孔径为0.45 μm的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，置于5%脱脂奶粉中封闭2 h；加入一抗（TLR4、TNF-α、IL-6和HIF-1α）后4℃孵育过夜，以0.5%TBS-T溶液洗膜3次后再加入HRP标记的二抗进行反应，以0.5%TBS-T溶液洗膜3次用化学发光法进行显色，并采用软件进行灰度值分析，计算各目标蛋白与β-actin的灰度比值。
1.4.4 HE染色 取各组大鼠部分新鲜肺组织，以4%中性甲醛溶液固定后做连续切片，常规HE染色后进行病理检测，具体检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。
1.5 统计学方法
采用SAS 10.0統计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病理学观察
图1为各组大鼠肺组织HE染色后100倍光镜下观察，假手术组肺组织未见明显异常，肺泡组织结构清楚，仅见极少量红细胞及炎症细胞浸润于肺泡腔；B为IRI模型组可见肺泡结构紊乱，肺泡间隙增宽，肺毛细血管充血明显，肺泡腔内大量的红细胞，炎性细胞浸润；TRL4激活组可见大鼠肺组织病变程度较IRI模型组更加严重；TRL4抑制组可见大鼠肺组织中的病变程度较IRI模型组轻微。
2.2 各组大鼠肺湿重/干重值比较
IRI模型组肺湿重/干重值高于假手术组，TLR4激活组肺湿重/干重值高于IRI模型组，TLR4抑制组肺湿重/干重值低于IRI模型组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表1。
2.3 各组大鼠肺组织中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平比较
IRI模型组肺组织中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平均高于假手术组，TLR4激活组肺组织中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平高于IRI模型组，TLR4抑制组肺组织中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平低于IRI模型组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表2。
2.4 各组大鼠肺组织中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表达水平比较
IRI模型组肺组织中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表达水平高于假手术组，TLR4激活组肺组织中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表达水平高于IRI模型组，TLR4抑制组肺组织中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表达水平低于IRI模型组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表3、图2。
3 讨论
肺IRI是一种较为复杂的病理、生理过程，多在肺移植、体外循环、肺袖式切除、肺动脉成形、肺动脉血栓内膜剥脱、心肺复苏及创伤等情况下发生，患者表现多为肺水肿、肺血管阻力增加、微循环通透性增加、肺动脉高压等，严重时甚至导致死亡[10-12]。研究表明，肺缺血再灌注损伤的发生和发展与炎症介质释放、氧化应激反应、细胞内转超载、细胞死亡诱导、中性粒细胞活化以及保护性介质的减少等因素有关[13-14]，其中，炎性反应和缺氧在这一过程中发挥了重要的作用。有研究表明，炎症和缺氧可以协同作用，炎症环境会导致氧含量持续下降，而细胞耗氧量的增加又会导致炎性反应和组织损伤的加剧，进而促进缺血再灌注损伤的发展[15-16]，但是具体机制目前尚不完全清楚，可能与TLR4信号通路介导HIF-1α的变化有关。因此，本研究将大鼠分别静脉注射脂多糖、TAK-242和生理盐水干预后再建立肺缺血再灌注损伤，并对各组再灌注损伤后3 h的相关实验室指标进行了分析比较。
本研究发现，建立灌注模型后，IRI模型组大鼠病理检测发现肺泡结构紊乱，炎性反应较为明显，TRL4激活组大鼠的肺组织病变程度较IRI模型组更加严重，而TRL4抑制组大鼠肺组织中的病变程度较IRI模型组轻微；IRI模型组大鼠肺湿重/干重值高于假手术组，TLR4激活组肺湿重/干重值高于IRI模型组，而TLR4抑制组肺湿重/干重值低于IRI模型组，上述结果提示肺缺血再灌注模型建立成功。TRL4激活组添加脂多糖后大鼠肺部可见明显炎性反应，且肺湿重/干重值明显偏高，而TLR4抑制组添加TRL4抑制剂后炎性反应明显降低，进一步说明TRL4在肺缺血再灌注损伤的發生和发展过程中发挥了重要作用，但其具体机制仍需做进一步深入研究。
本研究利用RT-PCR技术和Western-blot技术分别对各组大鼠肺组织中TLR4、HIF-1α mRNA和蛋白水平进行检测发现，IRI模型组大鼠肺组织mRNA和蛋白水平均明显高于假手术组，而TLR4激活组较IRI模型组更高，TLR4抑制组mRNA和蛋白水平均明显低于IRI模型组，提示脂多糖能明显激活TLR4通道，促进TLR4的分泌和相关蛋白的表达，而利用TLR4特异性抑制剂将TLR4通道抑制后可明显降低TLR4、HIF-1α mRNA及蛋白表达水平。
HIF-1α是一种重要的缺氧相关调节因子，其可与下游的缺氧反应元件结合后调控下游基因的激活，而HIF-1α与TLR4之间也存在着密切联系[17]。本研究发现，特异性TLR4配脂多糖干预后可明显促进HIF-1α的累积及活化，并能抑制HIF-1α蛋白的降解，说明IRI中缺氧及TLR4激活可协同作用，增加HIF-1α的累积及活化，二者在大鼠肺缺血再灌注损伤的发生和发展过程中可能发挥着重要作用，但具体机制仍需做更深入研究。
本研究利用RT-PCR技术和Western-blot技术分别对各组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白水平进行检测发现，IRI模型组mRNA和蛋白水平均高于假手术组，而TLR4激活组更高，但TLR4抑制组mRNA和蛋白水平均明显低于IRI模型组。TNF-α和IL-6作为促炎症因子均可以诱导中性粒细胞趋化和其他炎症因子的产生，导致缺血再灌注损伤的发生[18-19]。本研究发现，TLR4可上调TNF-α和IL-6等炎症因子水平，促进炎性反应的发展，进而导致缺血再灌注损伤的加重。同时也表明，HIF-1α在TLR4信号通路介导的肺IRI中发挥着重要作用，其可上调继发性损伤性因子等因素，促进细胞凋亡及炎性反应；而抑制TLR4激活通道后可明显抑制HIF-1α的活性，进而降低各项炎症因子水平，但能否将抑制HIF-1α的活性作为一种新的治疗靶点仍需做进一步的深入研究。
本研究采用不同方式干预处理后制作大鼠肺IRI模型并检测各项指标发现，脂多糖激活TLR4后可促进缺氧因子HIF-1α的分泌和表达，并能上调炎症因子水平，促进炎性反应的发生和发展，进而导致肺IRI加重，这与相关文献的结果基本一致[20]。但本研究限于研究样本量不足，对于TLR4信号通路介导HIF-1α水平变化的具体机制仍需进一步深入研究。
综上所述，大鼠肺IRI后肺组织中TLR4信号通路介导HIF-1α水平显著升高，从而增加对肺组织的炎症损伤程度。
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（收稿日期：2016-11-17 本文编辑：程 铭）