转OsCYP2基因水稻后代的遗传分析及农艺性状观察
摘要：通过对转OsCYP2基因水稻（Oryza stativa L.）吉农大30后代的PCR检测，发现转基因后代中大部分株系分离比率符合3∶1的遗传比率，依此推断该部分植株中插入片段的遗传分离方式符合孟德尔遗传规律；对转基因植株及对照植株（吉农大30）的农艺性状进行观察比较后发现转基因植株的平均穗长、穗粒数、结实率、株高以及千粒重等性状表现低于对照，但是分蘖数明显增加，生育期延长，而且转基因株系之间变异性较大。
关键词：水稻（Oryza stativa L.）；转基因；OsCYP2基因；遗传分离比例；农艺性状
中图分类号：S511 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）07-1510-02
由于基因工程育种可以打破植物杂交的种间隔离，实现不同物种之间基因的转移与整合，以获得其他育种方法难以得到的优良性状，因而应用基因工程进行育种工作具有巨大的价值。随着转基因方法、技术的改进，转基因技术在在育种领域显现出越来越大的应用前景[1]。完善的转化技术要求外源基因能够在转化体及其后代中得到稳定、高效的表达，基因工程能否在创造新种质、新品种方面得到成功应用也完全取决于外源基因在转基因植物中能否保持稳定的遗传表达，因此开展外源基因在转基因植物中遗传表达的稳定性研究具有重要意义[2]。另一方面，转化体农艺性状的表现一直是育种工作者关心的问题之一，也决定了转基因作物能否被直接应用。从已有的报道来看，转基因当代植株及其自交衍生后代农艺性状与原亲本相比一般表现较差[3-7]。本研究以转OsCYP2基因水稻（Oryza stativa L.）为材料，对其后代进行分子检测以及农艺性状观察，旨在为转OsCYP2基因水稻的进一步研究及应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以吉林农业大学水稻育种课题组前期获得的转OsCYP2基因水稻吉农大30 T2代植株为材料，并以非转基因吉农大30为对照。
1.2 试验方法
试验于2011年在吉林农业大学农学院抗盐碱水稻试验田及吉林省白城市镇赉县盐碱试验田进行，分别种植转基因水稻T2代植株及对照植株。苗期采用潮霉素进行初步筛选，水稻插秧后剪取幼嫩叶片，使用改良后的CTAB法提取DNA，采用35S启动子特异引物组合（F：5′ATGGATTTGTAGAGAGAGAC 3′，R：5′CTAGGAGAGCTFGCCGCAGT 3′）进行扩增检测。扩增体系为20 μL体系，引物（浓度均为10 μmol/mL）各1 μL，DNA模板（100 ng/μL）1 μL，2×PCR mix 10 μL，ddH2O 7 μL。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30次循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行目的条带的检测，对阴性植株和阳性植株数量进行统计，并进行χ2测验以确定其分离比例。根据检测结果分别调查水稻生育期、株高、分蘖、穗长、每穗粒数、结实率及千粒重等农艺性状并与对照进行比较与分析。
2 结果与分析
2.1 转基因水稻的分子检测及遗传分析
PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后进行检测并拍照记录，部分检测结果如图1所示。由图1可以看出，阳性植株的DNA经35 S启动子特异引物组合扩增产生了205 bp的目标扩增条带，而阴性植株中未出现相同条带，说明所检测基因片段可以传递到下一代植株中。统计阳性植株与阴性植株数量并进行χ2测验，共检测31个株系，其中有20个株系符合3∶1的分离规律，即有64.5%的转基因株系阳性植株与阴性植株比例为3∶1，遗传方式符合孟德尔遗传，其余株系分离比与3∶1的遗传比例不符，出现不同的分离比可能是由于目的基因片段插入方式、位置以及数量的不同而导致，其原因有待进一步验证。
2.2 转基因植株的农艺性状
转基因植株与对照植株的农艺性状统计结果见表1。由表1可知，转基因植株的平均穗长、每穗粒数、结实率、株高以及千粒重等性状表现均比对照差，但是分蘖数明显增加，生育期延长，而且转基因株系之间各性状变异性较大，其原因可能是外源基因插入或组织培养导致变异发生。
3 小结与讨论
通过对转OsCYP2基因水稻后代的DNA检测及田间农艺性状的观察，发现转基因后代中大部分株系分离比率符合3∶1的遗传比率，依此推断该部分植株中插入片段的遗传分离方式符合孟德尔遗传规律；对转基因植株及对照植株的农艺性状进行比较后发现转基因植株的平均穗长、每穗粒数、结实率、株高以及千粒重等性状与对照相比表现较差，但是分蘖数明显增加、生育期延长，而且转基因株系之间各性状变异较大，推测其原因可能是由于外源基因的插入以及组织培养所造成。
随着分子遗传学的发展，转基因技术在现代农业育种中得到了极为广泛的应用，各种功能基因被转入不同植株以获得新的育种材料，并在许多领域取得了较大进展，在水稻抗盐碱育种方面，曾有科学家将甜菜碱生物酶合成基因codA及betA等导入水稻中以获得盐碱抗性增强的水稻材料[8，9]，将OsCYP2等亲环素类基因导入水稻植株中以增强抗性的研究正在广泛开展[10]，转基因后代中插入基因的遗传稳定性对于转基因材料的育种应用价值至关重要。一般来说，由基因枪法导入的外源基因插入位置及拷贝数等均存在较大的差异，难以进行控制，后代遗传方式也较为复杂；而农杆菌介导法导入的基因拷贝数一般较少，整合位置较为固定，故其遗传稳定性较好。本研究中所检测株系大部分符合孟德尔遗传定律，也初步验证了这一说法，进一步的验证有待于Southern杂交等实验的进行。
在转基因植株农艺性状的表现方面，大量的试验表明转基因植株的农艺性状在早代一般表现较大变异，有利变异与不利变异均较为常见，而随着世代的增加其农艺性状会逐渐趋向于与原受体材料相同，究其原因一般认为是由于早代植株受到外源基因插入及组织培养对于受体材料遗传物质的平衡影响较大[11]，本试验中的农艺性状观察结果也验证了这一说法。而对于转OsCYP2基因水稻的其他特征特性则有待于进一步更为详细的试验研究。
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