LMP1经Wnt1/β—catenin途径促进鼻咽癌干细胞SP18增殖

材料与方法

1.1细胞与质粒 鼻咽癌干细胞SP18由中山大学肿瘤研究所建立并惠赠，细胞培养采用低血清（2%～5%）血清（购自杭州四季青公司）的RPMI1640（Gibco BRL公司）培养。逆病毒质粒pLNSX-LMP1和pLNSX-LMP1TRADD（LMP1的CTAR2区域TRADD突变）[5-7]由中南大学肿瘤研究所构建并惠赠。

1.2细胞生长曲线 取2×103个SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞接种于24孔板种中，每组均接种3个平行孔细胞，培养24 h后，每天2组取3孔细胞计数，重复计数3次，取均值为每组细胞数，连续计数细胞6 d，将所得不同时间计数细胞数连接后，绘制出细胞生长曲线。

1.3平板克隆形成实验 分别取300个SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞接种于24孔板中，每组均接种3个平行孔，将24孔板置于培养箱中培养2周后，观察细胞克隆形成情况，每孔加入1 ml甲醇进行细胞固定1 h后，加入0.5 ml的0.4%结晶紫染色15 min，肉眼计数细胞克隆，每孔重复计数3次，取3孔均值为每组克隆数，然后计算细胞克隆形成率，为形成克隆数比接种细胞数即为克隆形成率。

1.4软琼脂集落实验 用琼脂糖制备0.6%底层琼脂，冷却后用琼脂糖及细胞制备0.3%顶层琼脂（每孔含2×103个细胞）。实验设SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞组，每组3个平行孔，然后将24孔板置于37℃ 5% CO2温箱内培养2周后。观察集落形成情况并计数，其中细胞数大于50个细胞为1个集落，每孔重复计数3次，取3孔均值为每组集落数。计算细胞集落形成率为集落数比接种细胞数即为集落形成率。

1.5 Western-blot检测蛋白表达 收集细胞，提取细胞总蛋白，以30 μg总蛋白/泳道，进行10% SDS不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜、封闭，一抗（1∶1000）室温孵育滤膜1 h，洗膜，HRP标记二抗（1∶1000）室温孵育滤膜1 h，洗膜后曝光、显影、定影，分析结果。

1.6统计学处理 采用SPSS22.0统计分析软件进行分析，计量资料数据用（x±s）表示，两组间均数比统计分析采用t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 LMP对SP18细胞生长的影响 将LMP1及LMP1TRADD导入SP18后，结果显示，SP18-LMP1细胞生长速度明显快于SP18-LMP1TRADD细胞的生长，说明LMP1可以促进SP18细胞的生长，而其CTAR2区域TRADD在促进SP18细胞生长中发挥重要作用（P<0.05），见图1。

注：#SP18-LMP1 vs. SP18-LMP1TRADD，P<0.05

图1 SP18-LMP1与SP18-LMP1TRADD细胞的生长曲线

2.2 LMP对SP18细胞增殖的影响 将LMP1及LMP1TRADD导入SP18后，结果显示，SP18-LMP1形成的细胞克隆与集落数量及体积均大于SP18-LMP1TRADD细胞，同样说明LMP1可以促进SP18细胞的增殖，而其CTAR2区域TRADD在促进SP18细胞增殖中发挥重要作用（n=3，P<0.05），见表1。

2.3 Western-blot检测NF-кB P65蛋白的表达 为了解LMP1的CTAR2区域TRADD促进SP18细胞增殖的作用机制，采用Western-blot检测LMP1对SP18細胞Wnt1通路的影响。结果显示，SP18-LMP1细胞中Wnt1与β-catenin蛋白的表达较SP18-LMP1TRADD高，而p-β-catenin蛋白表达低，说明LMP1活化Wnt1/β-catenin通路，而CTAR2区域TRADD是通路活化的重要部位。

注：1：SP18-LMP1细胞；2：SP18-LMP1TRADD细胞

图2 Western-blot检测Wnt1、β-catenin与

p-β-catenin蛋白的表达

3讨论

自Hamburger等[10]提出肿瘤干细胞（tumor stem cell，TSC）以来，不同组织来源的TSC不断被分离，如乳腺癌[11]、肝癌[12]和肺癌[13]等。肿瘤组织TSC细胞数量少，其具有干细胞特性，被认为是恶性肿瘤发生和复发的根源。目前，鼻咽癌干细胞的生物学行为仍不清楚，其在NPC的作用及对转移、复发、耐药等的影响仍有待深入研究。EB病毒感染与NPC发生发展密切相关，在人体常潜伏感染，编码多种潜伏蛋白[2-4]。其中LMP1是EB病毒基因组编码促细胞癌变和转移作用的重要致瘤蛋白[5-7]。

LMP1蛋白作为EB病毒编码的重要致瘤蛋白，其在细胞功能的完成依赖于羧基端胞浆区的3个功能结构域，其中CTAR2（351～386aa）位于羧基端胞浆区末端，是羧基端重要的功能活性区域，能与TRADD蛋白结合，参与介导高水平NF- B及AP-1的活化[6-9]。本研究结果显示，将LMP1导入SP18细胞后，CTAR2的TRADD活性区LMP1突变体促SP18生长及增殖能力均明显低于野生型LMP1，说明LMP1-CTAR2的TRADD活性区参与了其促SP18细胞增殖的作用。

肿瘤干细胞中存在多条重要的信号途径，其中Wnt/β-catenin途径就是其中之一。细胞内Wnt途径包括两条，其一是决定细胞命运的经典通路，其二是控制细胞运动与组织极性的非经典通路[14]。Wnt经典途径参与细胞质内β-catenin稳定、其进行核转位，入核参与基因表达的调控。β-catenin游离于细胞质内并异常积聚，促进其入核。β-catenin量的蓄积、入核是Wnt/β-catenin信号途径活化的关键[15]。Wnt1/β-catenin通路的活化在肿瘤发生发展过程中具有十分明显的作用[16]。

本研究结果显示，SP18-LMP1细胞中Wnt1与β-catenin蛋白的表达较SP18-LMP1TRADD高，而p-β-catenin蛋白表达低，说明LMP1促进SP18细胞中Wnt1与β-catenin蛋白表达，且使β-catenin磷酸化抑制，导致细胞浆中游离β-catenin含量增加且入核量也上升，从而激活Wnt-1/β-catenin途径，从而发挥其促进SP18细胞增殖的作用，结果说明LMP1的CTAR2可能通过TRADD位点活化Wnt-1/β-catenin途径促进SP18细胞增殖，但如何发挥调节功能有待后续深入研究。

参考文献：

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收稿日期：2017-11-22；修回日期：2017-11-23

編辑/杨倩

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