ZnPcS2P2介导的光动力疗法诱导HL—60细胞凋亡的分子机制
【摘要】 目的：探讨ZnPcS2P2介导的光动力学疗法（ZnPcS2P2- PDT）诱导HL-60细胞凋亡的分子机制。方法：应用DNA倍体分析检测ZnPcS2P2-PDT对HL-60细胞细胞周期的影响，应用RT-PCR方法检测ZnPcS2P2-PDT对HL-60细胞Bcl-2、C-myc、人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）与Fas等基因mRNA表达的影响。结果：ZnPcS2P2-PDT阻止HL-60细胞从G1期进入S期，使细胞阻滞在G1期；并出现凋亡峰。ZnPcS2P2-PDT处理后，HL-60细胞中Bcl-2、C-myc与hTERT等基因mRNA表达水平显著下降，而Fas基因的mRNA表达水平上升。结论：ZnPcS2P2-PDT可将HL-60细胞阻滞在G1期，诱导细胞凋亡，可能通过下调Bcl-2、C-myc与hTERT，上调Fas基因表达而发挥作用。
【关键词】 酞菁锌； 光动力学疗法； 凋亡； HL-60细胞
doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2016.31.007 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2016）31-0014-03
【Abstract】 Objective：To study of the molecular mechanisms of ZnPcS2P2 mediated light therapy （ZnPcS2P2-PDT） induced HL 60 apoptosis.Method：The effects of ZnPcS2P2-PDT on HL-60 cells，cell cycle were determined by DNA analysis detected by flow cytometry.The expression of Bcl-2，C-myc，hTERT（human telomerase reverse transcriptase）and Fas mRNA were detected by RT-PCR.Result：HL-60 cells were stopde from G1 phase to S phase by ZnPcS2P2-PDT， the cell were blocked in G1 phase，and appeared apoptosis phase.The mRNA expression level of Bcl-2，C-myc and hTERT decreased significantly after ZnPcS2P2-PDT.The mRNA expression of Fas increased significantly after ZnPcS2P2-PDT. Conclusion：ZnPcS2P2-PDT could arrest HL-60 cells at G1 phase and induce apoptosis by reducing the mRNA expression level of Bcl-2，C-myc and hTERT，and up-regulating the mRNA expression of Fas.
【Key words】 Zine phthalocyanine Photodynamic therapy； Apoptosis； HL-60 cells
First-author’s address：Fujian Provincial Maternity and Children’s Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350001，China
光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）是一种发展中的肿瘤治疗新方法[1]。PDT对肿瘤细胞作用的基本原理为：光敏剂接受特定波长光的光能后，通过光化学反应和能量传递过程将光能转化为分子内能，在有氧条件下，产生多种活性氧物质（ROS），ROS对生物大分子产生破坏作用，使细胞的结构和功能受到严重影响，从而干扰肿瘤细胞的生长并导致其死亡，以達到治疗目的[2]。本课题组前期研究结果表明ZnPcS2P2介导的光动力学疗法（ZnPcS2P2-based-photodynamic therapy，ZnPcS2P2-PDT）对白血病细胞有显著的选择性杀伤作用、较好的净化效果[3]，并可诱导白血病细胞发生线粒体相关凋亡[4]。本研究将从分子水平上初步探讨ZnPcS2P2-PDT对白血病HL-60细胞的杀伤机制，为从分子水平调节白血病细胞凋亡、增强PDT的抗白血病效应提供实验依据。
1 资料与方法
1.1 光敏剂ZnPcS2P2
由福州大学化学系黄金陵、陈耐生教授提供，事先将ZnPcS2P2溶于溶剂，溶剂组成为Cremophor EL 2%（V/V），1，2丙二醇20%（V/V），NaCl 0.9%（W/W）。避光，4 ℃保存。用生理盐水稀释成系列浓度即为即用型。
1.2 细胞系及培养体系
HL-60细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。培养条件：含10%灭活胎牛血清（杭州四季青生物制品研究所），2 mmol/L L-谷氨酰胺，常规剂量青、链霉素的RPMI-1640培养液（GIBCO BRL）， 置37℃、5%CO2饱和湿度的CO2培养箱中培养， 隔天半量换液。细胞为对数生长期，存活细胞百分率（台盼兰拒染法）>95%， 以备实验。
1.3 ZnPcS2P2-PDT处理细胞
用RPMI1640培养液重悬HL-60细胞，细胞密度为5×106/ml， 加入终浓度为0.5 μg/ml的ZnPcS2P2，孵育5 h后光照。同时设立空白对照组、光照对照组（单纯光照）、光敏剂对照组（单纯与0.5 μg/ml ZnPcS2P2共孵育，不光照）。光照条件：由LD-670半导体激光机（由天津医科大学激光医学研究室研制）输出的670 nm激光以53 mW/cm2的功率密度、2.1 J/cm2的能量密度照射。于光照后6、12、24 h收集细胞。
1.4 DNA倍体分析检测ZnPcS2P2-PDT对HL-60细胞细胞周期的影响
细胞用PBS洗涤后，用Kenesis 50试剂（Bio-Rad）染色，置流式细胞仪（美国BD公司）检测，应用Cell modifit软件分析细胞周期。
1.5 ZnPcS2P2-PDT对HL-60细胞bcl-2、c-myc、hTERT与Fas等基因mRNA表达的影响
应用TRIZOl（Life Technology）提取各组细胞总RNA，所提取的RNA OD260 ： OD280>1.8，经电泳可见明亮清晰的18 s与28 s
两条rRNA带，说明RNA完整。cDNA合成及扩增体系参见文献[5]。所用试剂均来自Promega公司产品。以β-actin为内参照，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析仪（Gel Doc 1000型，Bio-Rad）分析，比较各组扩增产物荧光强度。所用引物由上海生物工程公司合成，引物序列、片段长度及退火温度见表1。
1.6 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件处理数据，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ZnPcS2P2-PDT对HL-60细胞周期的影响
ZnPcS2P2-PDT处理后，随着继续孵育时间的延长，G0/G1期的HL-60细胞比例逐渐升高，上升幅度越来越明显；于6 h出现了凋亡峰（Sub G1），随后该峰逐渐明显，24 h达到（22.75±3.96）%，差异有统计学意义（P<0.05）；S期的细胞由（67.69±0.45）%降到（42.63±1.23）%， 差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
2.2 ZnPcS2P2-PDT对HL-60细胞Bcl-2、C-myc、hTERT和Fas mRNA表达的影响
在任何时间段，各基因mRNA的表达水平在三个对照组HL-60细胞中表达相似。ZnPcS2P2-PDT处理HL-60细胞后，Bcl-2、C-myc和hTERT的mRNA表达下调，而Fas mRNA表达上调。Bcl-2 mRNA表达于PDT处理后12 h时，下降较明显；C-myc也是于12 h时有明显减弱，24 h时更显著；hTERT在6 h时就减弱，24 h时减弱最显著。Fas mRNA表达水平于ZnPcS2P2-PDT处理后6 h就有较明显增强，见图1。
3 讨论
凋亡相关基因的表达在肿瘤的发生发展中起重要的调控作用，其中某些基因发生缺失或过度表达可导致细胞增殖失控或凋亡受阻，并产生抗药性。因此，如何调控凋亡相关基因或其相应产物的表达提高肿瘤细胞对干预因素的敏感性、诱导细胞凋亡，是肿瘤治疗取得成功的关键。目前，研究较多的凋亡相关基因包括Bcl-2、C-myc、hTERT和Fas等。本研究从分子水平上初步探讨ZnPcS2P2-PDT对HL-60细胞内一些凋亡相关基因mRNA 表达的影响，为从分子水平调节白血病细胞凋亡、增强PDT的抗白血病效应提供实验依据。
本研究结果显示ZnPcS2P2-PDT处理后，G0/G1期的HL-60细胞比例明显增高、S期的细胞比例下降，ZnPcS2P2-PDT处理后出现凋亡峰，上述结果表明ZnPcS2P2-PDT阻止细胞从G1期进入S期，使细胞阻滞在G1期，并发生细胞凋亡。许多血液系统恶性肿瘤高表达Bcl-2。Bcl-2基因是一种敏感的PDT光损伤目标[6]，PDT可使Bcl-2基因发生裂解和交联而被破坏。本研究结果显示Bcl-2mRNA表达于PDT处理后显著下降， C-myc原癌基因参与细胞周期G1/S时相转换的调控，HL-60细胞C-myc 表达水平高出正常细胞10倍，本研究结果表明ZnPcS2P2-PDT可在转录水平上抑制C-myc基因表达，因此推测C-myc基因也是ZnPcS2P2-PDT抑制HL-60細胞增殖、诱导细胞凋亡的调控点。端粒酶具有抗凋亡作用， 端粒酶激活是细胞永生化和肿瘤生成的重要步骤，抑制其活性可以诱导细胞的凋亡[7]；hTERT是端粒酶的组成成分之一，其表达与端粒酶活性密切相关，是端粒酶活性表达的唯一限制性组分。本研究结果显示HL-60细胞hTERT mRNA表达显著受抑。提示ZnPcS2P2-PDT可能通过抑制hTERT基因的表达降低端粒酶的活性，从而促进HL-60细胞凋亡。另有资料表明，C-myc可诱导hTERT基因表达而激活端粒酶[8]。本研究结果还显示ZnPcS2P2-PDT可明显上调Fas基因表达，提示ZnPcS2P2-PDT也可能通过启动Fas/FasL细胞凋亡途径而抑制HL-60细胞增殖。笔者将进一步研究Caspase-8在ZnPcS2P2-PDT诱发的细胞凋亡中的作用，揭示Fas/FasL途径在ZnPcS2P2-PDT抗白血病过程中所发挥的作用。
参考文献
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（收稿日期：2016-07-23）