miR—103a—3p在胰腺癌细胞中的表达及意义
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【摘要】 目的：观察miR-103a-3p 抑制表达的慢病毒载体对高表达miR-103a-3p的PANC-1胰腺癌细胞株的表达抑制作用，为阐明胰腺癌的发病机制及筛选治疗靶基因提供理论依据。方法：采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测不同侵袭能力的胰腺癌细胞株（PANC-1、BxPC-3）和永生化正常胰腺细胞（H6C7）中miR-103a-3p表达情况；构建慢病毒载体miR-103a-3p-inhibitor，包装后感染高表达miR-103a-3p的PANC-1细胞株，荧光显微镜观察其转染效率，qRT-PCR检测其表达情况。结果：qRT-PCR检测显示，miR-103a-3p在PANC-1、BxPC-3细胞及正常胰腺细胞H6C7细胞中相对表达量分别为（4.949±0.130）、（1.417±0.120）和（1.010±0.151），PANC-1表达水平最高（P<0.05）。miR-103a-3p-inhibitor慢病毒感染 PANC-1细胞第
4天，荧光显微镜下可见报告基因绿色荧光蛋白（GFP）高强度表达。qRT-PCR结果显示：miR-103a-3p相对表达量在未感染miR-103a-3p-inhibitor慢病毒的PANC-1组（1.002±0.160）与阴性病毒感染的PANC-1组（0.956±0.250）间差异无显著性，但慢病毒感染的PANC-1组的相对表达量（0.317±0.320）显著下降（P<0.05）。结论：miR-103a-3p在侵袭能力较强的胰腺癌细胞株中表达增高，miR-103a-3p-inhibitor能稳定转染PANC-1细胞系并抑制其miR-103a-3p表达。
【关键词】 miR-103a-3p； 胰腺癌； 慢病毒
【Abstract】 Objective： To observe the expression inhibition of miR-103-a-3p in PANC-1 pancreatic cancer cell lines infected by lentivirus with miR-103a-3p-inhibitor， and to provide theoretical basis for elucidating the pathogenesis of pancreatic cancer and screening novel target genes for the treatment of .pancreatic cancer. Method：The expression of miR-103a-3p in two pancreatic cancer cell strains （PANC-1 and BxPC-3） with different invasiveness and the normal pancreatic ductal epithelial cell line （H6C7） were detected by using qRT-PCR. Lentivirus vectors with miR-103a-3p-inhibitor were constructed and used to infect PANC-1 cell with high expression level of miR-103a-3p. Transfection efficiency was observed by fluorescence microscope and the expression of miR-103a-3p were detected by qRT-PCR. Result：qRT-PCR showed that the relative quantitative expressions of miR-103a-3p in PANC-1， BxPC-3 and H6C7 cell strains were （4.949±0.130）， （1.417±0.120） and （1.010±0.151）， respectively. miR-103a-3p was expressed at highest level in PANC-1 cell. After infected by lentivirus with miR-103a-3p-inhibitor， PANC-1 cells were found to express green fluorescent proteins at high level. qRT-PCR indicated that there were no significant differences in the relative quantitative expressions of miR-103a-3p between PANC-1 cells uninfected by lentivirus with miR-103a-3p-inhibitor vector （1.002±0.160） and PANC-1 cells infected by lentivirus with negative control vector （0.956±0.250）， but significant reduction of the relative quantitative expressions of miR-103a-3p in PANC-1 cells infected by lentivirus with miR-103a-3p-inhibitor vector （0.317±0.320） were detected（P<0.05）.Conclusion：miR-103a-3p is expressed at higher level in pancreatic cancer cells with stronger invasion ability. miR-103a-3p-inhibitor can be transfected stablely into PANC-1 cells and inhibit the expression of miR-103a-3p.
【Key words】 miR-103a-3p； Pancreatic cancer； Lentivirus
胰腺癌的发病率与死亡率基本接近，预后极差。胰腺癌临床表现不典型，且具有浸润侵袭生长的生物学特性，病程进展较快，大多数患者在诊断后1年内死亡，5年生存率<6%[1]。胰腺癌的早期浸润转移以及术后局部或全身极易出现复发转移是胰腺癌致死的主要原因。随着对肿瘤发生发展、侵袭转移、治疗、预后及耐药等分子机制研究的深入，从基因水平阐述胰腺癌的发生发展及侵袭转移，并通过基因治疗胰腺癌可能是未来有效且安全的途径。
miRNAs是一类仅有17～25 nt的小分子单链RNA，不编码蛋白质，主要是通过与mRNA中3"非编码区（3"UTR）配对抑制或降解mRNA，在转录后发挥负性调控作用。miRNA不但在增殖凋亡、分泌代谢、生长发育等生理过程中发挥作用，而且在包括肿瘤在内的诸多疾病等病理过程中扮演重要角色。miRNA表达不但可抑制抑癌基因发挥致癌基因作用，亦可发挥抑癌基因起抑癌作用，且不同肿瘤、同一肿瘤不同时期表达miRNA种类及表达量均不一样，在肿瘤发生发展中的各个调控过程发挥重要作用[2]。近年来研究发现miRNA中miR-103的异常表达可能参与胰腺癌的发生、发展[3-6]，但是对于其侵袭转移的具体机制仍未阐明。本研究检测不同侵袭性胰腺癌细胞株表达miR-103a-3p水平，进一步观察表达抑制慢病毒载体转染高表达miR-103a-3p的PANC-1胰腺癌细胞株后对其表达的抑制作用，为阐明胰腺癌的发病机制及筛选治疗靶基因提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 细胞株和质粒 人正常胰腺细胞系H6C7购自中山大学肿瘤防治研究中心，人胰腺癌细胞系PANC-1与BXPC-3购自上海中科院细胞所，慢病毒包装细胞293T细胞购自上海Genechem基因公司。GV-159载体、辅助包装载体pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体购自上海Genechem公司。
1.1.2 试剂和试剂盒 DMEM高糖培养基（美国Hyclone）、KSFM培养基（美国Life Technologies）、胰蛋白酶（北京Solarbio）、胎牛血清（美国Gibco）、rEGF、BPF（以色列ProSpec）RNA酶抑制剂（北京Solarbio）、Rnase inhibitor（北京天恩泽公司）、RNA marker（美国Sigma）、SYBR® PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit（TaKara公司）、慢病毒包装试剂盒（上海Genechem）、Lipofectamine 2000（美国Invitrogen）、质粒抽提试剂盒（德国Qiagen公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与RNA提取及浓度和完整性检测 PANC-1、BXPC-3采用含10%胎牛血清的DMEM培养，H6C7采用含细胞因子rEGF、BPF的KSFM培养基培养。取各对数生长期细胞，常规方法提取细胞总RNA，用分光光度计测定吸光值分析RNA纯度。1.5%琼脂糖电泳检测RNA完整性。
1.2.2 实时荧光定量PCR检测miRNA-103a-3p的表达 按试剂盒说明书，采用SYBR® PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit检测PANC-1、BXPC-3与H6C7细胞的miRNA-103a-3p。引物序列：miR-103a-3p：CCATTGTACAGGGCTATGAAAA；U6（内参）：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT。37 ℃、60 min下进行Poly（A）加尾、逆转录反应。PCR反应条件：95 ℃、5 s预变性；95 ℃变性60 s、55 ℃退火30 s、
72 ℃延伸30 s，共40个循环。在荧光定量PCR仪上进行反应，待结束后用PCR仪自带软件进行分析，获得产物CT值。各细胞组中miR-103a-3p相对表达量计算方法为：2-∆∆Ct=癌细胞的（CtmiR-103a-3p-CtU6）-正常细胞的（CtmiR-103a-3p-CtU6）。
1.2.3 慢病毒载体的构建与包装 合成hsa-miR-103a-3p-inhibitor引物序列：F：5’-AATTCAAAAAAGCAGCATTGTACAGGGCTATGA-3’，R：5’-CCGGTCATAGCCCTGTACAATGCTGCTTTTTTG-3’，PCR扩增后，将产物克隆到慢病毒载体GV159上，构建慢病毒载体GV-159。同时设未进行任何序列加工的空壳病毒载体（吉凯基因公司构建的商业载体）作为慢病毒载体GV-159的阴性对照。将质粒抽提试剂盒提取的慢病毒包装系统DNA溶液（含GV-159或空壳病毒载体，pHelper 1.0，pHelper 2.0）的稀释液与Lipofectamine 2000 试剂的稀释液混匀、温育，制备DNA/Lipofectamine 2000稀释液复合物，转染293T细胞48 h后取含病毒颗粒上清液，离心获取病毒浓缩液（miR-103a-3p-inhibitor病毒和空壳载体阴性对照病毒），荧光法测定病毒滴度。
1.2.4 稳定转染细胞株的筛选与鉴定 接种高表达miR-103a-3p的PANC-1细胞，使其培养过夜后细胞融合度大约为50%，去除完全培养基，加入包装的miR-103a-3p-inhibitor病毒或阴性对照病毒，使MOI（感染指数=病毒数/细胞数）=50，培养12 h后更换为完全培养基继续培养，72 h后用倒置显微镜观察GFP荧光，计算病毒对PANC-1细胞的感染效率。按上述方法进行qRT-PCR，鉴定稳定转染细胞株中miR-103a-3p的表达。
1.3 统计学处理 实验结果采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料均用（x±s）表示，使用单因素方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各细胞株总RNA完整性分析 分别取胰腺癌细胞系PANC-1、BxPC-3和永生化正常胰腺细胞H6C7总RNA于1.5%琼脂糖凝胶电泳，可见28S、18S、5S三条带，且28S的亮度为18S的两倍，无其他杂带（图1），表明提取的总RNA质量好，可用于下一步实验。
2.2 各细胞株miR-103a-3p的表达 以正常胰腺细胞H6C7作为对照组，miR-103a-3p在PANC-1、BxPC-3和H6C7细胞中相对表达量分别为（4.949±0.130）、（1.417±0.120）、（1.010±0.151），两两组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05），miR-103a-3p在PANC-1表达量最高（图2）。
2.3 miR-103a-3p-inhibitor慢病毒滴度 将收获慢病毒液进行倍比稀释（10、1、10-1 μL）后分别感染293T细胞，3 d后荧光显微镜下1 μL病毒液基本上可将5×106/mL细胞全部感染（图3），计算病毒原液病毒浓度约5×108 TU/mL，此浓度可用于下一步慢病毒转染实验。
2.4 慢病毒感染PANC-1细胞株 慢病毒感染PANC-1细胞第4天，在荧光显微镜下可见miR-103a-3p-inhibitor慢病毒感染组（命名为Control-PANC-1组）和阴性对照慢病毒感染组（命名为NC-PANC-1组）中报告基因GFP表达强度高，在细胞胞浆中聚集成团块状，在未感染空白对照组中未见荧光表达（图4）。
2.5 慢病毒转染细胞后qRT-PCR检测miR-103a-3p相对表达量 以胰腺癌细胞PANC-1作为对照组，未转染PANC-1组相对表达量（1.002±0.160）与NC-PANC-1组（0.956±0.250）相比，无明显差异（P>0.05），而Control-PANC-1组（0.317±0.320）分别与NC-PANC-1组相比，其表达量显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）（图5）。
3 讨论
miRNA在肿瘤的发生进展、侵袭转移、诊断预后、耐药以及评估治疗反应等方面起重要作用。随着miRNA深入研究，越来越多的信息提示miRNA为胰腺癌的诊断、治疗以及判断预后提供一个新的进展方向[7-12]。
miR-103作为miRNA家族中的一员，包括miR-103-1和miR-103-2，位于泛酰酸激酶（PANK）家族中两个成员PANK3 和PANK2的内含子区域。鉴于目前的理论基础以及胰腺癌组织芯片结果中miR-103异常高表达，笔者推测miR-103a-3p在胰腺癌的发生发展及侵袭转移过程中发挥一定作用。本研究选择两株侵袭能力高低不同的胰腺癌细胞株（PANC-1>BxPC-3）和一株永生化正常胰腺细胞（H6C7）作为研究对象，因这些细胞株在相关研究中比较深入且被文献[13-14]认可。
miR-103在卵巢癌、乳腺癌中高表达，在恶性间皮瘤中低表达，能促进肿瘤细胞增殖及有助于肿瘤的诊断，胰腺癌组织中的miR-103高表达与其他miRNA联合检测有助于胰腺癌的诊断[15-17]。本研究应用qRT-PCR检测发现，胰腺癌细胞中的表达量明显要高于正常胰腺细胞，与相关研究中胰腺癌组织中高表达结果一致，这也初步证实了miR-103a-3p表达上调与胰腺癌的发生具有一定的关联[10]。miR-103与肿瘤的相关生物学进展密切相关，miR-103在子宫内膜癌、食管癌、结肠癌中高表达，与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关，并可影响患者的预后[18-20]。本实验发现三株细胞中miR-103a-3p均有一定量表达，相对正常胰腺细胞H6C7来说，侵袭力较强的PANC-1细胞中表达最高，提示miR-103a-3p可能参与胰腺癌的发生发展。
Moncini等[21]在利用miR-103 的反义寡核苷酸和siRNA载体能降低治疗人类神经母细胞瘤中miR-103的表达，且能使该肿瘤细胞侵袭的能力降低很多，从而阻止肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。燕海娇 [22]利用慢病毒介导microRNA-20a过表达后能抑制胰腺癌细胞的增殖以及侵袭转移。本研究中将抑制miR-103a-3p表达的特异性载体进行慢病毒包装并感染高表达miR-103a-3p的PANC-1细胞，发现转染miR-103a-3p抑制表达的慢病毒后的细胞中miR-103a-3p表达水平显著下降，进一步提示miR-103a-3p可能参与促进胰腺癌的进展，并可能作为胰腺癌治疗的靶位。
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（收稿日期：2014-10-15） （本文编辑：蔡元元）