佐剂及其功能和作用机制
摘要：介绍了佐剂的分类、功能及作用机制，其作用机制主要包括：作为疫苗在体内的贮存库;诱导并调节免疫应答;改变免疫应答方式;延长活化的免疫细胞存活时间。
关键词：佐剂;分类;功能;作用机制
中图分类号 S852.4 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2015）02-062-02
Adjuvant and Its Function and Action Mechanism
LI Xia-ying1， HUANG Xiao-dong2， LIU Su2* （1.Development Center of Science and Technology， MOA， Beijing 100122; 2.Institute of Vegetables and Flowers of Chinese Academy of Agricultural Sciences/Vegetable Quality Supervision and Testing Center of Ministry of Agriculture， Beijing 100081）
Abstract The classification， function， action mechanism of adjuvant were introduced.The action mechanism mainly includes： as a storage of vaccine in vivo， inducing and adjusting immune response， changing immune response way， prolonging activation of immune cell survival time.
Key words Adjuvant; Classification; Function; Mechanism of action
作者简介 李夏莹、黄晓冬为并列第一作者;李夏莹（1986- ），女，云南玉溪人，助理研究员，博士，从事病原与宿主相互作用机制研究;黄晓冬（1984-），男，江西九江人，实习研究员，硕士，从事农产品农药残留研究。*通讯作者，研究员，硕士，从事农产品质量安全风险评估及检测技术研究。
收稿日期 2014-11-29
“Adjuvant”，即佐剂一词来源于拉丁文“Adjuvare”，是帮助的意思[1]。佐剂的概念是1924年法国兽医免疫学家Ramon首先提出的，他把免疫佐剂定义为与抗原同时应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力的物质[2]。佐剂是一种先于抗原或与抗原同时注入机体时可有效增强免疫应答的强度或改变免疫应答的类型的非特异性免疫增强剂。笔者从佐剂的分类、功能、作用机制3个方面对其进行了概述，旨在为合理使用佐剂提供参考。
1 佐剂的分类
根据来源、作用的机制和理化性质的不同，免疫佐剂分为不同的类型[1]（表1）。
表1 佐剂的类型
2 佐剂的功能
佐剂的功能可以概括为：增强抗体应答;增强疫苗的黏膜传递，增进免疫接触;促进产生细胞免疫;增强弱免疫原的免疫原性，如高度纯化的抗原或重组抗原;减少抗原接种剂量和接种次数;促进疫苗在免疫应答能力弱的人群中的免疫效果;加快免疫应答的速度和延长持续时间;改变抗原的构型;改变体液抗体的种类、IgG亚类和抗体的亲和性[3]。
3 佐剂的作用机制
佐剂加强免疫反应是一个十分复杂的过程，到目前为止，佐剂的作用机理还不是十分清楚。但是积累的试验结果表明佐剂在以下几个方面具有作用。
3.1 作为疫苗在体内的贮存库
有长期和短期贮存库，后者产生持续式或脉冲式释放。铝盐佐剂和油包水乳剂是典型的短期贮存库[4] ，该种类型的抗原包裹于注射部位，因此不会由于肝脏的清除作用而丢失。注射8～10 d后切除注射部位，对应答强度和持久性无影响，说明抗原在这一阶段被清除或屏蔽。
铝盐佐剂是将佐剂与抗原混合，形成凝胶状态，注入动物体内后形成“贮存库”，这些不溶性颗粒能吸附、分散抗原物质，增加抗原表面积，在组织中形成一个富含巨噬细胞的肉芽肿，延缓吸收。肉芽肿中的抗原缓慢地渗透到组织中，从而延长了抗原的刺激时间，使在正常情况下只能存留数日的抗原保持达数周之久。微球佐剂能在长达数月的时间内以持续或脉冲的形式释放抗原。持续性释放模拟了许多小型促进剂的释放方式，即彼此间结合紧密从而缓慢释放抗原;脉冲式释放模拟了传统的团块型佐剂的释放方式来增强免疫效果[5]。
合成多聚物如聚乳酸微球（PLG）能产生长期贮存库效应，产生的中心体降解形成脉冲式释放。这些中心体大小超过10 μm，使得其包含成分（免疫原和佐剂）存留于注射部位直到被APC生物降解清除，其释放时间可长达1～6个月[6]。
3.2 诱导并调节免疫应答
单独使用抗原一般不易引起有效的机体免疫应答，当在疫苗中加入佐剂后能够引起细胞/体液免疫应答。目前尚不清楚佐剂是如何引起机体免疫应答的，但是很多试验结果表明一些佐剂作为微生物模式分子激活DCS上的TLRs，进而引起肌体的细胞和体液免疫应答。 mDCs和pDCs是佐剂作用的靶细胞[7]。DCs在激活T/B方面起着主要作用。它能诱导B细胞分化成浆细胞并产生抗体;能诱导T细胞分化形成Ⅰ类（Th1）和Ⅱ类（Th2）辅助性T细胞及细胞毒性T细胞。当使用佐剂和抗原一起免疫机体后，抗原被提呈的数量增加。mDCs上的共刺激分子和MHC分子数量增加，细胞因子和趋化因子分泌增多[8-9]。TLRs在DCs激活淋巴细胞中起了重要作用：TLRs被激活后引起DCs分泌IL-6，IL-6抑制了调节性T细胞（Treg）的活性[10]，NK和NKT细胞被激活[11]。外源性的抗原经过抗原交叉提呈的方式和MHCⅠ类分子结合并提呈到DCs表面，诱导产生抗原特异性的CTL[12]。TLRs信号可促进DCS对外源性抗原的交叉提呈[13]。
TLRs是一类非常重要的先天性免疫识别受体，除此之外，TLRs在适应性免疫方面也发挥非常重要的作用。TLRs在机体Th1反应方面发挥重要作用。DCs表面的TLRs被激活后，通过依赖于MyD88及不依赖于MyD88的信号途径诱导细胞产生IL-12和IFN-γ等细胞因子，进而诱导辅助性T细胞向Th1方向发育，从而引起机体产生抗原特异性的细胞免疫[14-20]。
TLRs除了影响Th1和Th2的发育外，还直接或间接地影响调节性T细胞。同时，TLRs对由DCs决定的T细胞分化及T细胞的功能都有作用[21]。
综上所述，作为佐剂的微生物模式分子激活DCS上的TLRs，通过依赖于MyD88及不依赖于MyD88的信号途径调节免疫应答。
3.3 改变免疫应答方式
外源性抗原提呈过程首先要有专职抗原提呈细胞（APC）。APC是外源性抗原进入机体后引发免疫应答的第一关。抗原提呈细胞主要包括树状突细胞（DC）、皮肤中的朗罕氏细胞（LC）及单核-巨噬细胞。抗原被受体介导的胞吞作用或流动相胞饮作用摄取，产生的核内体与溶酶体融合，形成内溶酶体。该过程可能由粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）主导，它将DC指引到局部输出淋巴结或脾脏，进行抗原加工或提呈[22]。抗原在溶酶体中水解酶的作用下被水解成小肽，这些小肽与Ⅱ类MHC结合，MHC II已在内质网中进行装配并经过高尔基体加工。两者产生的复合物转运至APC表面，多肽与MHCII发挥作用最终引起体液免疫反应[23]。但是在使用了皂苷作为佐剂与乱清白蛋白的抗原表位混合后对动物进行免疫，可引起动物产生针对乱清白蛋白的特异性细胞毒性T细胞[24]。由此可见，使用皂苷佐剂改变了机体产生免疫应答的方式。
3.4 延长活化的免疫细胞存活时间
给动物注射纯化的蛋白质抗原会引起抗原特异性T细胞增殖，但是增殖的细胞很快就会死亡[25-27]。因此，给动物免疫该类抗原很少会得到比免疫前更多的抗原特异性T细胞。该种活化引起的调亡（AICD）过程对于动物来说可能非常重要。因为利用该种方法动物可以快速地减少并清除那些对自身抗原有反应的T细胞从而避免获得自身免疫病。然而，AICD可能对动物也是有害的，因为如果快速清除的是入侵微生物的抗原特异性T细胞，那么动物就缺少抵抗外源微生物入侵的能力。人们发现在免疫动物的同时使用添加加热致死的结核分枝杆菌或大肠杆菌脂多糖（LPS）成分的不完全弗氏佐剂后，AICD就会降低[27-28]。Mitchell等研究发现，佐剂在抑制AICD所起的作用在一定程度上是通过IκB家族成员BCL3来实现的。他们使用基因芯片检测了使用佐剂的抗原免疫动物的RNA，发现BCL3的表达量增加了几十倍，并且在体外和体内试验中都发现当大量表达BCL3后多会减少AICD[29]。
在只有抗原和B7-1共刺激分子信号（第1信号和第2信号）存在的情况下，成熟而未接触过抗原的T细胞不能被有效活化，或者活化后不能形成有功能的T细胞。只有在IL-12（第3信号）也存在的情况下，T细胞才能很好地被活化[30]。IL-12是许多佐剂诱导炎症反应的产物，并且可代替佐剂诱导形成针对抗原肽的T细胞。使用IL-12替代佐剂和抗原一起免疫动物可很好地引起T细胞克隆扩增、产生效应性T细胞和记忆性T细胞（抗原由DCs交叉提呈给CD8+细胞来引起细胞免疫[31]）[32-33]。使用佐剂免疫动物后诱导炎症反应，产生的IL-12细胞因子上调了T细胞中的BLC-3，最终减少了AICD，并形成针对免疫原的记忆性T淋巴细胞[33]。
到目前为止，FDA只批准了铝盐作为人用疫苗的佐剂，原因就在于任何一种佐剂对机体都是有害的。Edelman等指出，绝对安全的佐剂是不存在的，人们只能根据其作用机制尽可能保持一种微妙的平衡以达到最大的免疫刺激作用和最小的毒副作用[34]。因此，了解佐剂的作用机理对于合理使用佐剂非常重要。
参考文献
[1] HUNTER R L.Overview of vaccine adjuvants：present and future[J].Vaccine，2002，20（3）：7-12.
[2] RAMON G.Sur la toxine et surranatoxine diphtheriques[J].Ann Inst Pasteur，1924，38，1-7.
[3] SINGH M，O"HAGAN D T.Recent advances in veterinary vaccine adjuvants[J].Int J Parasitol，2003，33：469-478.
[4] AIKAWA K，MATSUMOTA K，UDA H，et al.Prolonged release of drug from O/w emulsion and residence in rat nasal cavity[J].Pharm Dev Technol，1998，3：461-469.
[5] BOWERSOCK T L，MARTIN S.Vaccine delivery to animals[J].Adv Drug Deliv Rev，1999，38：167-194.
[6] COOMBES A G，LAVELLE E C，DAVIS S S.Biodegradable lamellar particles of poly（lactide） induce sustained immune responses to a single dose of adsorbed protein[J].Vaccine，1999，17：2410-2422.
[7] TAKEDA K，KAISHO T，AKIRA S.Toll-like receptors[J].Annu Rev Immunol，2003，21：335-376.
[8] BANCHEREAU J，BRIERE F，CAUX C，et al.Immunobiology of dendritic cells[J].Annu Rev Immunol，2000，18：767-811.
[9] KAISHO T，AKIRA S.Toll-like receptors as adjuvant receptors[J].Biochim Biophys Acta，2002，1589：1-13.
[10] SCHNARE M，BARTON G M，HOLT A C，et al.Toll-like receptors control activation of adaptive immune responses[J].Nat Immunol，2001，2：947-950.
[11] GLI-ESPOSTI M A，SMYTH M J.Close encounters of different kinds：dendritic cells and NK cells take centre stage[J].Nat Rev Immunol，2005，5：112-124.
[12] ARDAVIN C，AMIGORENA S.Reis e Sousa Dendritic cells：immunobiology and cancer immunotherapy[J].Immunity，2004，20：17-23.
[13] AKAZAWA T，MASUDA H，SAEKI Y，et al.Adjuvant-mediated tumor regression and tumor-specific cytotoxic response are impaired in myD88-deficient mice[J].Cancer Res，2004，64：757-764.
[14] HEMMI H，TAKEUCHI O，KAWAI T，et al.A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA12[J].Nature，2000，408：740-745.
[15] PULENDRAN B，KUMAR P，CUTLER C W，et al.Lipopolysaccharides from distinct pathogens induce different classes of immune responses In vivo 11[J].J Immunol，2001，167：5067-5076.
[16] THOMA-USZYNSKI S，KIERTSCHER S M，OCHOA M T.Activation of toll-like receptor 2 on human dendritic cells triggers induction of IL-12，but not IL-109[J].J Immunol，2000，165：3804-3810.
[17] DE JONG E C，VIEIRA P L，KALINSKI P.Microbial compounds selectively induce Th1 cell-promoting or Th2 cell-promoting dendritic cells In vitro with diverse Th cell-polarizing signals 16[J].J Immunol，2002，168：1704-1709.
[18] MOISAN J，CAMATEROS P，THURAISINGAM T，et al.TLR7 ligand prevents allergen-induced airway hyperresponsiveness and eosinophilia in allergic asthma by a MYD88-dependent and MK2-independent pathway14[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2006，290：987-995.
[19] CELLA M，SALIO M，SAKAKIBARA Y，et al.Maturation，activation，and protection of dendritic cells induced by double-stranded RNA15[J].J Exp Med，1999，189：821-829.
[20] SIELING P A，CHUNG W，DUONG B T，et al.Toll-like receptor 2 ligands as adjuvants for human Th1 responses10[J].J Immunol，2003，170：194-200.
[21] XU D，LIU H，KOMAI-KOMA M.Direct and indirect role of Toll-like receptors in T cell mediated immunity[J].Cell Mol Immunol，2004，1：239-246.
[22] BORRELLO I，PARDOLL D.GM-CSF-based cellular vaccines：a review of the clinical experience[J].Cytokine Growth Factor Rev，2002，13：185-193.
[23] GERLIER D，TRESCOL-BIEMONT M C，ETTOUATI L，et al An accessory peptide binding site with allosteric effect on the formation of peptide-MHC-II complexes？ [J].C R Acad Sci III，1998，321：19-24.
[24] NEWMAN M J，WU J Y，GARDNER B H，et al.Saponin adjuvant induction of ovalbumin-specific CD8+ cytotoxic T lymphocyte responses[J].J Immunol，1992，148：2357-2362.
[25] KAWABE Y，OCHI A.Programmed cell death and extrathymic reduction of Vbeta8+ CD4+ T cells in mice tolerant to Staphylococcus aureus enterotoxin B[J].Nature，1991，349：245-248.
[26] WEBB S，MORRIS C，SPRENT J.Extrathymic tolerance of mature T cells：clonal elimination as a consequence of immunity[J].Cell，1990，63：1249-1256.
[27] KEARNEY E R，PAPE K A，LOH D Y，et al.Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo[J].Immunity，1994，1：327-339.
[28] VELLA A T，MCCORMACK J E，LINSLEY P S，et al.Lipopolysaccharide interferes with the induction of peripheral T cell death[J].Immunity，1995，2：261-270.
[29] MITCHELL T C，HILDEMAN D，KEDL R M，et al.Immunological adjuvants promote activated T cell survival via induction of Bcl-3[J].Nat Immunol，2001，2：397-402.
[30] CURTSINGER J M，SCHMIDT C S，LINS D C，et al.Inflammatory cytokines provide a third signal for activation of naive CD4+ and CD8+ T cells[J].J Immunol，1999，162：3256-3262.
[31] BEVAN M J.Cross-priming for a secondary cytotoxic response to minor H antigens with H-2 congenic cells which do not cross-react in the cytotoxic assay[J].J Exp Med，1976，143：1283-1288.
[32] SCHMIDT C S，MESCHER M F.Adjuvant effect of IL-12：conversion of peptide antigen administration from tolerizing to immunizing for CD8+ T cells In vivo[J].J Immunol，1999，163：2561-2567.
[33] CURTSINGER J M，LINS D C，MESCHER M F.Signal 3 determines tolerance versus full activation of naive CD8 T cells：Dissociating proliferation and development of effector function[J].J Exp Med，2003，197：1141-1151.
[34] EDELMAN R，HARDEGREE M C，CHEDID L.From the national institute of allergy and infectious diseases.summary of an international symposium on potentiation of the immune response to vaccines[J].J Infect Dis，1980，141：103-112.