大杯伞柄多糖与菌丝体粗多糖的免疫识别方法初探
材料与方法
1.1供试菌株及动物
大杯伞（C. maxima）菌株及其伞柄由漳州福建嘉田农业开发有限公司提供。
新西兰雌性大白兔（4月龄，2.1 kg）购自上海市松江区车墩实验动物良种场，许可证号为SYXK（沪）2008-0045。
1.2主要仪器与试剂
蛋白质纯化仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）、LC10A高效液相色谱仪（日本岛津公司）、ST-360酶标仪（上海科华实验系统有限公司）。蛋白-多糖偶联剂SULFO-NHS（美国Thermo Scientific公司）；rProtein A Sepharose亲和层析预装柱和生化测定试剂盒（生工生物工程上海股份有限公司）； UltrahydrogelTM2000 GPC水溶性凝胶色谱柱（美国Waters公司），RID-10A示差折光检测器（日本岛津公司）；弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂（美国Sigma公司）；其余化学试剂均为国产市售AR级。
郑恒光，等：大杯伞柄多糖与菌丝体粗多糖的免疫识别方法初探
1.3大杯伞柄的化学组成分析
依据国家标准GB5009系列（2010版）测定[9]。
1.4大杯伞菌丝体培养及粗多糖提取
按照文献[3]的方法培养大杯伞菌丝体，并用热水法从菌丝体中提取多糖，制得菌丝体粗多糖冻干粉。
1.5大杯伞柄多糖的提取及纯化
采用乙醇沉淀、Sevag法、凝胶过滤、离子交换等方法，按照文献[3]的步骤进行多糖的提取和纯化，制得大杯伞柄多糖冻干粉。
1.6大杯伞柄多糖纯度检测
采用高效排阻色谱法检测，使用UltrahydrogelTM2000 GPC水溶性凝胶色谱柱， RID-10A示差折光检测器，流动相为：添加了0.13 moL/L NaCl 的0.025 moL/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0），流速0.5 moL/L，进样量10 μL，检测时间30 min，柱温25 ℃。
1.7大杯伞柄多糖-蛋白偶联物的化学合成
采用碳二亚胺法[10-11]对大杯伞柄多糖和牛血清白蛋白进行化学偶联，将偶联反应产物采用Sepharose CL-4B凝胶过滤，收集偶联物（第1峰），除去未偶联的多糖（第2峰）和BSA（第3峰）。偶联物中的蛋白质和多糖含量分别采用福林酚试剂法[12]检测和苯酚硫酸法[13]检测。
1.8大杯伞柄多糖偶联物的抗血清制备
新西兰雌性大白兔暂养7 d后，以1.7制备获得的大杯伞柄多糖-蛋白偶联物为抗原进行免疫注射。第1次免疫注射与第2次免疫注射间隔10 d，以后每次间隔1周，共注射6次。第l次免疫将偶联物与等体积弗氏完全佐剂（FCA） 混合乳化后进行兔背部皮下多点注射，后5次免疫改为偶联物与等体积弗氏不完全佐剂（FIA）混合后直接在耳缘静脉注射。除第1次免疫注射量为1 mg外，其余均用0.5 mg。免疫全部结束后，耳静脉采血20 mL备用。
1.9亲和层析法纯化大杯伞柄多糖抗体
按照文献[12]的方法对制备的抗体进行纯化。血清与pH 7.0、0.02 mol/L磷酸盐缓冲液按体积比1∶1混合稀释，上样至1 mL rProtein A Sepharose亲和层析预装柱。
1.10大杯伞柄多糖的抗体滴度检测
第3次免疫后隔周耳静脉采血1 mL，采用间接ELISA法检测抗体滴度[14]，未偶联大杯伞柄多糖抗原用0.05 mol/L碳酸盐（pH=9.6）按100 μg/mL包板，并用酶标仪在450 nm波长下测定OD值。
1.11大杯伞柄多糖抗体检测
抗体浓度采用紫外分光光度计检测，抗体浓度（mg/mL）=OD280×1。大杯伞柄多糖及大杯伞菌丝体粗多糖与检测抗体的抗原-抗体反应采用ELISA法检测。检测结果以平均值±标准差（X±S）表示，使用SPSS11.0 软件，采用one-way ANOVA SNK法进行分析。
2 结果与分析
2.1大杯伞柄的化学组成分析
从表1可以看出，大杯伞柄是一种富含蛋白和碳水化合物的物质，几乎不含脂肪。该碳水化合物的组成以纤维素和半纤维素为主，几乎不含木质素。
2.2大杯伞柄多糖分离纯化及化学偶联
大杯伞柄粗多糖纯化后的提取率和多糖含量见表2，其中，Sevag法除蛋白后的大杯伞柄多糖进行Sepharose CL-4B凝胶过滤图谱（图1）表明，纯化后的大杯伞柄多糖主要由单一组分组成，含量占50%以上，其出峰位置靠近排阻峰，表明该多糖分子量在百万道尔顿以上。使用DEAE离子交换树脂（图2）对第1个峰的多糖组分进一步纯化表明，主要以中性多糖为主，还含有少量酸性多糖和蛋白质。经4个步骤纯化后的多糖通过高压液相凝胶色谱（图3）分析，表明其为单一组分的中性多糖。采用碳二亚胺法将多糖和牛血清白蛋白化学偶联后，产物中的多糖含量为偶联反应前的56.3%，偶联物中多糖和蛋白质比例为1∶0.89。
2.3大杯伞柄多糖抗血清的制备与抗体纯化
动物免疫实验表明，大杯伞柄多糖蛋白偶联物初次免疫即可诱导多糖特异性IgG免疫应答，抗血清滴度随免疫次数的增多而增加。五次免疫后，多糖的IgG抗体滴度显著上升。通过亲和纯化柱对抗血清中的抗体进行进一步提纯，其抗体滴度从16 K提高至64 K，已达到商业化检测抗体滴度水平。
2.4大杯伞柄多糖抗血清的特异性检测
大杯伞柄和菌丝体粗多糖的抗原-抗体反应ELISA检测数据（表3）表明，抗体稀释倍数在5 H～64 K时，大杯伞柄多糖检测结果为阳性（即：表3中数据右上角标记为 “*”的检测结果），而菌丝体粗多糖检测结果则为阴性。依据该检测结果，可初步判断这两种多糖在结构上存在差异。
3 讨论
多糖是一类重要的天然抗原，其免疫原性由组成多糖的单糖种类、数量、所形成的糖苷键类型以及侧链的分支度、与主链的连接方式等细微结构所决定。因此，每种多糖的免疫原性彼此不同，诱导产生的抗体特异性亦互不相同，这为制备多糖克隆抗体，进而开展多糖结构的免疫学方法研究提供了可能性[15]。
免疫方法对糖链结构的分析，主要是利用抑制常数相近的多糖其结构相似的原理，探测未知结构的糖链对抗原和抗体的结合产生抑制，测定其抑制常数。有相近抑制常数的多糖，其结构也会比较相似。与己知结构的糖链的抑制常数相比较即可推测出未知结构的糖链中是否含有该序列[4，16-17]。
制备多糖与蛋白质偶联物首先要将多糖活化成高活性的多糖衍生物，通常可采用CNBr氰基化多糖。但CNBr为剧毒试剂，使用不便。笔者尝试采用新型的水溶性氰化剂N-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐（1-cyano-4-dimethylaminopyridinium， CDAP）来活化多糖，但发现CDAP活化后多糖几乎不溶于水，使得后续偶联和纯化操作难以进行，可见CDAP法不宜用于活化大杯伞柄多糖。笔者后来尝试采用碳二亚胺法偶联获得成功，其原理是糖基可以在水溶性碳二亚胺偶联试剂介导下和蛋白质上的羧基或氨基进行缩合以形成稳定的酰胺基结构。这是目前较为常用的偶联方法，该方法操作较为简单且产物的缀合度较高。反应体系中，己二酸二酰肼起到连接臂的作用，能适当增加多糖与蛋白质的空间距离，有利于偶联缀合度的增加，提高产物的免疫原性[9]。
一般而言，食用菌的子实体多糖和菌丝体多糖在结构和生物活性方面存在一定的差异[18-20]，本研究对大杯伞柄多糖和菌丝体多糖的结构和抗氧化活性差异分析结果也是如此。在多糖结构差异分析方面，与通常采用的化学法或物理法相比，免疫分析法不仅具有识别微小结构差异的能力，而且还具有快速、简便、不依赖于大型分析仪器的优点。笔者下一步将对这两种多糖的结构差异以及伞柄多糖抗体的免疫识别部位进行深入研究。
总之，本实验初步建立了大杯伞柄多糖的分离纯化、化学偶联以及制备多糖抗体的方法，获得了对大杯伞柄多糖具有特异性免疫的血清。相关的研究结果有助于免疫学研究方法在食用菌多糖结构研究领域的推广应用。
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