咳喘宁口服液对支气管哮喘大鼠PI3K信号转导途径的影响
摘要：目的 观察咳喘宁口服液对呼吸道合胞病毒诱发支气管哮喘（以下简称“哮喘”）大鼠CD4+、CD8+T细胞内磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-110α表达的影响，探讨其防治病毒诱发哮喘的机理。方法 将SD大鼠随机分为磷酸盐缓冲液（PBS）对照组、模型组、地塞米松+沙丁胺醇组（阳性药组）和咳喘宁组。建立卵白蛋白哮喘大鼠模型，并以呼吸道合胞病毒激发哮喘。采用磁珠结合法分离CD4+、CD8+T细胞，使用流式细胞仪检测T细胞内PI3K-110α的表达水平。结果 模型组大鼠CD4+、CD8+T细胞百分率及CD4+、CD8+T细胞内PI3K-110α的表达水平显著高于PBS对照组、阳性药组及咳喘宁组，差异有统计学意义（均P<0.01）。经Pearson相关分析，各组大鼠CD4+、CD8+T细胞百分率与CD4+、CD8+T细胞内表达的PI3K-110α的表达水平无明显相关性。结论 CD4+、CD8+T细胞参与了哮喘免疫平衡调节，其表达的PI3K在病毒诱发哮喘模型中明显增高。咳喘宁口服液能抑制CD4+、CD8+T细胞内PI3K的表达，可能是其治疗哮喘的免疫机制之一。
关键词：支气管哮喘；磷脂酰肌醇-3-激酶信号转导；咳喘宁口服液；细胞培养；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.07.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）07-0030-03
Effect of Kechuanning Oral Liquid on Signal Transduction Pathway of PI3K in Asthma Rats Induced by Virus LUO Yin-he1， LI Hua1， YANG Jing-yi2， WANG Meng-qing2， HUANG Sheng2， HUANG Ting2， JIANG Ping2， JIAO Luo-jia1， LI Ying1 （1.Hunan University of TCM， Changsha 410208， China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of TCM， Changsha 410007， China）
Abstract：Objective To observe the effect of Kechuanning Oral liquid on the expression of P13K in CD4+ and CD8+T cells of asthma rats induced by respiratory syncytial virus （RSV）， and explore its mechanism of preventing and treating asthma induced by virus. Methods SD rats were randomly divided into phosphate-buffered saline （PBS） control group， model group， dexamethasone and salbutamol group （positive drug group）， and Kechuanning oral liquid group. Ovalbumin asthma rats model was built and induced by RSV. CD4+ and CD8+T cells were separated by magnetic beads method. The expressive level of PI3K-110α in T cells was detected by immumofluorescence method with flow cytometry. Results Compared with PBS control group， positive drug group and Kechuanning oral liquid group， the CD4+ and CD8+T cells percentage and the expression level of PI3K-110α in CD4+ and CD8+T cells of model group were significantly higher. The differences were statistically significant （P<0.01）. The CD4+ and CD8+T cells percentage was not associated with the expression level of PI3K-110α in CD4+ and CD8+T cells of each group by Pearson correlation analysis. Conclusion The CD4+ and CD8+T cells involve in the asthma immunity balanced modulation， and the level of PI3K expressed by CD4+ and CD8+T cells increase distinctly. Kechuanning oral liquid can restrain the expression of PI3K in CD4+ and CD8+T cells， which might be one of the immunologic mechanisms of treating asthma.
Key words：bronchial asthma；P13K signal transduce；Kechuanning oral liquid；cell culture；rats
研究表明，支气管哮喘（以下简称“哮喘”）与辅助性T细胞（Th）功能失衡有关，Th2过度活化、Th2型细胞因子大量分泌是气道炎症启动和维持的关键因素。目前已发现多种转录因子及细胞内信号途径与Th分化有关[1]。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信号转导通路是参与哮喘发病机制的一条重要受体信号转导
基金项目：国家自然科学青年基金（30901921）
通讯作者：王孟清，E-mail：wmqwmq2009@sina.com
途径[2]。研究发现，PI3K与哮喘的炎症反应、气道重构、气道黏液分泌及肺功能异常有关[3]。为进一步阐明咳喘宁口服液防治病毒诱发哮喘的机理，本研究观察了咳喘宁口服液对呼吸道合胞病毒（RSV）诱发哮喘大鼠CD4+、CD8+T细胞内PI3K表达的影响。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级雄性28～42 d的SD大鼠40只，体质量120～180 g，合格证号：SCXK（湘）2009-0004；新西兰大白兔10只，雄性，体质量1.2～1.5 kg，合格证号：2009-0012。普通标准饲料（碳水化合物60%、脂肪11%、蛋白质29%）。均由湖南中医药大学实验动物中心提供。
1.2 药物
咳喘宁口服液，湖南中医药大学第一附属医院制剂室生产，每瓶100 mL，含原药材70 g；硫酸沙丁胺醇雾化溶液（万托林），葛兰素史克公司生产，批号483153，规格5 mg/mL；地塞米松，天津药业焦作有限公司生产，批号10071112，规格5 mg/mL。
1.3 主要试剂与仪器
RSV（Long株），湖南师范大学试验中心提供；卵清白蛋白（OVA），美国Sigma公司；CD4+、CD8+T细胞阳性分选试剂盒及CD4-PE抗体、CD8-PE抗体均购自美国invitrogen公司；植物血凝素（PHA）、白细胞介素-4（IL-4）、小鼠抗人PI3K-110α单克隆抗体、羊抗鼠IgG-PE荧光抗体均购自美国Peprotech公司。FACS流式细胞仪，Becton Dickson公司；MIAS-2000图像分析仪，成都泰盟电子有限公司。
2 实验方法
2.1 咳喘宁药物血清制备
将新西兰大白兔10只适应性喂养3 d后灌服咳喘宁口服液25 g/kg体质量（相当于成人的临床等效剂量），每日2次，连续给药3 d，末次给药后2 h，兔耳中央动脉采血，无菌分离血清，经56 ℃、30 min灭活后备用。
2.2 分组与造模
40只幼年SD大鼠按体质量随机分为4组，分别为磷酸盐缓冲液（PBS）对照组、模型组、地塞米松+沙丁胺醇治疗组（阳性药组）、咳喘宁治疗组，每组10只。大鼠饲养于湖南中医药大学洁净动物实验室，每5只1笼，自由饮食，控制室温25 ℃左右，湿度55%左右。
所有动物适应性饲养1周后开始实验。采用本院已建立的方法并参照相关文献建立模型[4-5]。模型组、阳性药组和咳喘宁组大鼠分别于第1、8日分3处注射共1 mL含1 mg OVA和100 mg氢氧化铝凝胶的无菌抗原液（两下肢内侧皮下各注射0.25 mL，腹腔注射0.5 mL）致敏；第21、35、49日以滴度为1.0×106空斑形成单位（PFU）的RSV 50 µL鼻腔滴入。PBS对照组以PBS致敏、激发。
2.3 给药
造模完成当日开始给药。咳喘宁组大鼠置于容积为20 L的长方形玻璃罩内，罩底不封闭，罩侧面分别开一雾化气孔和一直径为2.5 cm左右的通气孔，用超声雾化器将药液雾化后经雾化孔导入罩内（该雾化器可将药液雾化成0.5～10 µm的细小均匀雾粒），每日连续雾化3 h，雾化量为0.5 mL/min（起始时可加大至1～1.5 mL/min，稳定后以0.5 mL/min维持），每日约雾化100 mL（相当于原药材70 g）；阳性药组每次将地塞米松注射液2.5 mg（0.7 mg/kg）、沙丁胺醇雾化溶液2.5 mg（0.7 mg/kg）溶于100 mL蒸馏水中，在相同条件下和时间内雾化治疗；PBS对照组、模型组以等量蒸馏水雾化吸入作为对照。各组雾化治疗时间均为7 d。
2.4 标本采集
2.4.1 分离大鼠外周血CD4+、CD8+T细胞 ①实验完成当日，用25%乌拉坦于大鼠下腹腔注射麻醉并固定于无菌解剖板上，腹部消毒后沿腹中线剪开分离腹主动脉，用2 mL肝素钠抗凝管采血。②将抗凝管中的血液移至离心管中，按1∶1比例加入Hank’s液，用水平离心机2000 r/min离心20 min，离心结束后， 可见管内由上至下分为血浆、单核细胞、分离液、粒细胞和红细胞共4层。③磁珠结合法分离CD4+、CD8+T细胞。
2.4.2 细胞计数及细胞活力鉴定 将重悬细胞稀释约100倍，充分混匀后用滴管取少许细胞悬液，滴加在洁净细胞计数板上，加盖盖玻片。静置片刻，在显微镜下观察计数板内4个大方格中的细胞数，并计算出细胞的浓度：细胞数/mL=4个大方格内的细胞总数/4×104×相应的稀释倍数。采用台盼蓝排斥实验法检测总细胞中活细胞所占百分比，根据公式计算细胞活力。每份标本至少计数200个细胞，重复计数3次，取均值。
活细胞率（%）=活细胞总数÷（活细胞总数+死亡细胞总数）×100%
2.4.3 细胞培养 将模型组、阳性药组和咳喘宁组大鼠提取的每种细胞悬液分装到3个培养皿中，每皿细胞悬液稀释到3 mL，分别加PBS 10 µL，地塞米松、沙丁胺醇各5 µL，咳喘宁药物血清10 µL，PBS对照组大鼠提取的每种细胞悬液中CD4+、CD8+T细胞加PBS 10 µL，每个培养皿中都加入细胞刺激剂PHA和IL-4，浓度分别为50 µg/mL和25 ng/mL。然后置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养72 h，收获细胞。
2.5 流式细胞仪检测
根据藻红蛋白（PE）荧光标记的抗体被激发出的荧光量多少，使用流式细胞仪检测T细胞内PI3K-110α的表达水平。每个样本测定3次，每次测定10 000个细胞，以阴性对照调整仪器，使变异系数在2%以内，测定结果为3次的平均值。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据为定量资料，用—x±s表示，所有数据均进行正态性检验。多组样本均数比较采用方差分析，方差齐者两两比较采用LSD检验，方差不齐者用Tamhane’t2检验。两变量的相关分析采用Bivariate过程的Pearson直线相关法。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果（见表1～表3）
表1 各组大鼠CD4+、CD8+T细胞百分率比较（—x±s，%）
组别只数 CD4+ CD8+
PBS对照组10 25.40±3.45 23.10±4.46
模型组10 48.93±8.93# 41.37±8.12#
阳性药组10 28.50±2.97▲ 22.10±5.75▲
咳喘宁组10 26.70±5.97▲ 20.90±4.25▲
注：与PBS对照组比较，#P<0.01；与模型组比较，▲P<0.01（下同）
表2 各组大鼠CD4+、CD8+T细胞内PI3K-110α表达水平比较（—x±s）
组别只数CD4+ CD8+
PBS对照组10 1.72±0.18 1.29±0.11
模型组10 2.13±0.22# 1.78±0.16#
阳性药组10 1.73±0.15▲ 1.42±0.11▲
咳喘宁组10 1.71±0.17▲ 1.34±0.13▲
表3 各组大鼠CD4+、CD8+T细胞百分率与PI3K表达水平相关性
组别CD4+与PI3K-110α CD8+与PI3K-110α
r值P值r值P值
PBS对照组0.0700.8480.0310.932
模型组0.0620.8640.1340.713
阳性药组0.2190.5440.1810.617
咳喘宁组0.1810.5170.2360.511
5 讨论
研究表明，RSV感染后，机体Thl/Th2平衡紊乱，Th2免疫应答优势，导致白细胞介素（IL）-2和干扰素-γ（IFN-γ）等明显减少，IL-4、IL-5、IL-10等增多，刺激嗜酸性粒细胞生长和分化，产生RSV特异性IgE和RSV特异性细胞毒[6]，Th2细胞过度的增殖分化是Th2型应答优势的病理基础，有效地干预Th2细胞过度增殖分化，对纠正Th2型优势应答，减轻哮喘气道炎症具有重要的作用[7]。
目前已知，Th2细胞增殖分化主要通过共刺激分子结合T细胞受体（T cell receptor，TCR）所介导的信号途径及IL-4α受体介导的信号途径来完成[8]，但两者在增殖分化过程中起作用的时相不同，涉及到的信号转导途径也有区别。共刺激分子结合TCR所介导的信号途径主要在抗原初次与CD4+、CD8+T细胞结合时发挥作用，起到激活T细胞的作用，而一旦CD4+、CD8+T细胞被初步激活，IL-4受体介导的信号途径则发挥主要作用。因此，IL-4受体介导的信号转导途径是Th2细胞增殖分化的最重要信号途径[9]。
有研究表明，PI3-K是IL-4受体介导信号途径下游的重要通路，它们介导了生理情况下IL-4所诱导的T淋巴细胞增殖[10]，在哮喘发作时存在明显异常[11]。因此，将信号转导途径中的转导蛋白PI3K作为干预靶点，寻求防治哮喘的有效药物具有重要意义。
咳喘宁口服液以传统古方五虎汤为基本方研制而成。方中麻黄乃“喘家圣药”，味苦辛、性温，能宣肺气，平咳喘，其主要含麻黄碱，具有抗炎、平喘和抗过敏效应；苦杏仁味苦、性微温，能降肺气平喘止咳。二药有宣有降，可祛除外邪，畅通气道，从而降低气道反应性，共为本方君药。石膏味辛甘、性大寒，功在清泄肺热；大青叶清热抗炎，具有抗病毒作用；黄芪扶正祛邪，能增强机体免疫功能，增强病毒诱生干扰素的能力，抑制病毒，并具有类似激素样作用。三药合用，可清除哮喘的激发因素，共为本方臣药。桃仁活血化瘀以改善微循环，改善炎症病灶，尚可止咳平喘；细茶叶味苦甘、性寒，功在清神化痰；甘草镇咳平喘，具有抗炎、抗变态反应作用，共为本方佐使。诸药合用，共奏发表清热、化痰平喘、清除哮喘激发因素、降低气道反应性等功效。前期研究表明，该方治疗病毒诱发儿童哮喘具有较好疗效，无论是总有效率还是临床控制率，均明显优于对照组[12]；临床疗效与年龄因素有关，年龄越小，疗效较好[13]。其机理与提高患儿IL-12水平、降低IL-4水平，从而调节Th1/Th2失衡[14]，以及能有效降低血和肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞数量、可溶性细胞间黏附分子-1水平有关[15]。
本研究表明，哮喘模型组大鼠CD4+、CD8+T细胞PI3K表达水平较PBS对照组高，进一步表明PI3-K110α信号转导通路在哮喘的发病机制中起着重要的作用。阳性药组及咳喘宁组CD4+、CD8+T细胞PI3K-110α表达水平与模型组比较显著下降，差异均有统计学意义（P<0.01）。说明咳喘宁口服液能抑制CD4+、CD8+T细胞PI3K的表达，这可能是其治疗哮喘的免疫机制之一。
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（收稿日期：2012-11-08，编辑：华强）