ＥＴＡ受体拮抗剂ＢＱ１２３对心肌梗死局部心肌组织中ＥＴ－１和ＥＴ受体分布的影响
【摘要】目的探讨在急性心肌梗死（AMI）时，使用内皮素受体A拮抗剂（ETA受体拮抗剂）后对局部心肌组织ET1和ET受体分布的影响。方法将22只兔随机分为4组，1周实验组(n=6)和1周对照组(n=5)，4周实验组(n=6)和4周对照组(n=5)，结扎左冠状动脉前降支建立AMI模型。实验组每天静脉滴注ETA受体拮抗剂BQ123，对照组每天使用等量生理盐水作相同处理，分别于1周和4周后取出心脏。采用免疫组化染色和图像分析法检测1周和4周各组动物左心室非梗死区、梗死边缘区和梗死中心区心肌组织的中ET1和ET受体的分布。结果免疫组化染色和图像分析结果显示：各实验组ET1和ET受体的分布均明显少于各自对照组相应部位（P<0.05）。结论AMI后，使用ETA受体拮抗剂能减轻局部心肌组织ET1和ET受体的上调程度。
【关键词】内皮素；内皮素受体拮抗剂；急性心肌梗死；免疫组化
收稿日期：2005－01－18
作者单位：336000江西宜春,宜春学院第一附属医院心内科作者简介：幸志强,男,1961年2月生，江西宜春人，医学学士，教授，副院长，Tel:13707959236
内皮素（endothelin，ET）是日本学者首先从猪的主动脉内皮细胞中分离纯化的一种小分子生物活性多肽［1］，是目前发现的最强烈的缩血管物质，分ET1、ET2和ET3三种亚型，均由21个氨基酸残基组成，其中ET1的生物学效应最强［2］。ET通过自分泌与旁分泌的方式，以局部激素的形式释放后，与ET受体结合而发挥其生物学效应。ET受体分为三型：在人类主要为ETA型受体和ETB型受体，在非哺乳动物的细胞中还可能存在ETC型受体。在人体心脏中以ETA受体为主，并且ETA受体与ET1亲和性最高、作用力最强。而ETA受体拮抗剂可拮抗ET1与ETA受体结合。近年来利用ETA受体拮抗剂治疗心肌梗死受到广泛关注，大量实验证实，特异性ETA受体拮抗剂能缩小急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)的梗死面积，以及改善心肌梗死后的左室重构来发挥对心脏的保护作用。然而，由于ET1对心脏的生理和病理生理功能还未完全明了，ETA受体拮抗剂对心脏的保护作用除了直接拮抗ET1与ETA受体结合之外，是否还可对梗死局部心肌组织中ET1与ET受体的分布产生影响而发挥其保护作用，目前还不清楚。本文拟对兔心肌梗死后使用选择性ETA受体拮抗剂BQ123对梗死局部心肌组织中ET1与ET受体分布的影响作一探讨，为其对心脏的保护作用提供更多的理论依据。
1材料和方法
1.1实验动物新西兰兔，年龄110～130d，平均122.8d，雌雄不限，体重2.5～3.5kg，平均2.8kg，由宜春学院动物科提供。
1.2试剂和仪器ETA受体拮抗剂BQ123，美国ALEXIS公
司生产，产品编号155004P005。ET1免疫组化染色试剂盒，天津灏洋生物技术有限公司生产，产品编号TSP2003。ET受体免疫组化染色试剂盒，天津灏洋生物技术有限公司生产,产品编号TSP2003。Mias2000图像分析系统，四川大学图像所研制。
1.3动物心肌梗死模型的建立及分组将22只兔随机分为4个组，1周实验组（n=6）和1周对照组（n=5），4周实验组（n=6）和4周对照组（n=5）。所有动物在禁食12h，禁饮2h后，按3%戊巴比妥钠1ml/kg从耳缘静脉缓慢推注，处于麻醉状态后固定于手术台上。在自主呼吸下，选择胸骨中线为切口，剪开胸骨暴露心脏（术中未破胸膜），分离左冠状动脉前降支，以无创针带20锦纶单丝线穿过左前降支根部，稳定10min后行双重结扎，梗死标志为：左心室前降支供血区明显发绀、收缩明显减弱。如无此改变则再次结扎血管，以确保结扎成功。观察20min后如未出现心律失常则关闭胸腔，逐层缝合肌肉和皮肤，术后静注青霉素钠抗感染3d。实验组均在冠脉结扎前15min开始从耳缘静脉滴注BQ123,按75μg/kg的剂量溶于150ml的生理盐水中每天静滴5h，按实验分组分别用1周和4周。对照组分别用等量生理盐水作同样处理。1周和4周后按上述手术方法再次开胸暴露心脏，从左心房注射氯化钾溶液使心脏停跳，取出心脏后迅速剪去左、右心房及右心室，用滤纸吸干左心室。然后从左室非梗死区、梗死边缘区及梗死中心区各取组织1块放入10%中性甲醛溶液(即4%甲醛，也即10%福尔马林)中固定。
1.4免疫组化染色及图像分析免疫组化染色操作按试剂盒说明书进行，行ET1和ET受体免疫组化染色后各组免疫组化切片应用mias2000图像分析系统对阳性反应产物进行半定量检测分析。每张切片在400倍放大下，随机选10个位点测量ET1或者ET受体免疫组化染色灰度值，然后取其平均值。灰度值从0到255共分为256个等级，灰度值越小表示免疫组化染色越深，抗原物质含量越高，反之则否。
1.5统计学处理数据以±s表示，用SPSS11.0统计软件包用单因素方差分析及两两比较、成组设计两样本均数比较的t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
ET1和ET受体阴性对照片未见特异性染色（图1A，1B）。
2.1ET1免疫组化染色结果1周对照组左室梗死中心区心肌细胞ET1呈阳性染色（图2），梗死边缘区和非梗死区心肌细胞染色深度明显变浅呈弱阳性染色。1周实验组梗死中心区呈弱阳性染色，梗死边缘区及非梗死区呈弱阳性。4周对照组梗死中心区心肌细胞染色明显浅于1周对照组呈阳性染色，梗死边缘区及非梗死区心肌细胞呈弱阳性或阳性染色。4周实验组梗死中心区心肌细胞呈弱阳性或阳性染色，梗死边缘区及非梗死区呈弱阳性染色。
2.2ET受体免疫组化染色结果1周对照组受累心肌各部位ET受体均呈阳性染色（图3），1周实验组受累心肌各部位均呈弱阳性染色。4周对照组和4周实验组心肌各部位呈弱阳性染色。
2.3图像分析及统计学处理
2.3.1ET－1免疫产物的灰度值(GL)比较见表1。与非梗死区和梗死边缘区相比，各组GL均以梗死中心区最低（P<0.01），非梗死区和梗死边缘区均无明显差别（P>0.05）；各实验组梗死中心区GL明显高于各自对照组梗死中心区(P<0.01)，其余两个部位也高于对照组相应部位（P<0.05）。这些提示梗死中心区ET1分布最多，ETA受体拮抗剂可抑制局部心肌组织中ET1的上调。
2.3.2各组心肌细胞ET受体免疫组化染色的GL见表2。各实验组和对照组GL均以梗死边缘区最低（P<0.05），梗死中心区和非梗死区均无明显差别（P>0.05）。各实验组3个部位GL均高于对照组相应部位（均为P<0.05）。提示梗死边缘区ET受体分布最多，而ETA受体拮抗剂可抑制局部心肌组织中ET受体的上调。
3讨论
ET可以在多种细胞中产生，如心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞等，AMI时缺血、缺氧的心肌细胞是最重要的合成部位［3］。ET1的合成、释放受多种因素的影响。心肌缺血、缺氧是刺激ET1大量合成、释放的最主要因素之一［3,4］；血液的高凝状态、儿茶酚胺的大量释放以及局部组织自发再血管化都可引起ET的合成和释放增多［5,6］；AMI时，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和醛固酮释放增多也可刺激心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞合成、释放ET1增加［7］。大量实验表明，AMI时，心肌组织缺血、缺氧，以及交感神经兴奋使儿茶酚胺分泌增多，血浆及局部心肌组织ET1水平均明显增高、表达增强［3,4,8］。ET受体数量和亲和力也受ET水平增高、缺血及缺氧等多种因素的调节，表现有上调和下调的现象，有证据表明，缺血心脏的ETA受体表达在ET1升高时不但不下调，反而有升高的趋势［3,8］。然而本实验发现AMI后使用ETA受体拮抗剂BQ123能减轻梗死局部心肌组织ET1和ET受体的上调程度。 免疫组化结果显示，AMI后局部心肌组织ET－1和ET受体均明显上调，ET－1和ET受体升高以梗死中心区最为显著，这进一步表明局部心肌组织ET－1的升高主要由心肌细胞的缺血、缺氧所致，这些结果和以往的报道是一致的［3,8,9］。使用ETA受体拮抗剂BQ123以后，各实验组局部心肌组织ET1和ET受体的水平均低于各自对照组，显示ETA受体拮抗剂BQ123能减轻心肌ET1和ET受体的上调程度。ETA受体拮抗剂抑制 局部心肌ET1上调，一方面可能是通过干扰ETA受体介导的自分泌正反馈机制来完成的；另一方面，使用ETA受体拮抗剂后对心功能及其它血流动力学因素的有益改善也对抑制ET1上调起到了辅助作用［10］。同时我们也观察到1周对照组梗死中心区心肌细胞ET1染色明显高于4周对照组，可能与AMI后ET1升高产生的负反馈机制有关［3］；也可能和AMI后心钠素（ANP）分泌增多［3］，ANP能明显抑制心肌细胞分泌ET1有关［11,12］。尽管心肌中ET受体的分布和表达机制目前还不清楚，但本实验结果所显示的ET1和ET受体的分布特点强烈提示心肌中ETA受体介导的信号转导机制在AMI的病理生理中起着显著的促进作用。ETA受体拮抗剂BQ123抑制心肌梗死局部心肌组织ET1和ET受体的上调而发挥对心脏的保护作用。
急性心肌梗死后使用ETA受体拮抗剂除了直接拮抗ET1与ETA受体结合而发挥其对心肌的保护作用外，还能减轻心肌梗死局部心肌组织ET1和ET受体的上调程度，从而减少ET1和ETA受体的结合，发挥其保护作用。
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