辣椒碱对小鼠淋巴细胞免疫调节活性的影响
材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物
SPF级健康Balb/e小鼠购自锦州医科大学实验动物中心。
1.1.2 试验药物
辣椒碱购自成都曼斯特生物科技有限公司;RPMI-1640培养基、台盼蓝和四甲基偶氮唑盐（ MTT）购自美国GIBCO公司;PBS缓冲剂购自上海生物技术服务公司;新生牛血清购自四季青生物工程有限公司;IFN-γ和IL-6试剂盒购白武汉博士德公司;三羟甲基氨基甲烷（ tris）购自南通润丰石油化工有限公司;DMSO购白Solarbio。
1.2 方法
1.2.1 小鼠脾脏淋巴细胞制备
把健康的BALB/C小鼠进行颈椎脱臼致死后，在无菌环境中剖开小鼠腹腔，摘除脾脏，将分离后的脾脏组织放于1个细胞筛中，将细胞筛放人装有PBS溶液的培养皿中。取1个无菌注射器，对其进行碾压，然后收集细胞筛外的PBS.1400 r/min离心15 min，收集悬液，加入ACK LysisBuffer（红细胞裂解液）放置5 min，1 400 r/min，离心15min，弃上清，重复2-3次。在5% CO2、37℃恒温条件下，用含10%新生牛血清的RPMI-1640完全培养基进行细胞悬浮培养，收集悬浮细胞。随后，用TrypanBlue染色鉴别，活细胞数要达到95%以上[9-10]。
1.2.2 淋巴细胞增殖检测
在96孔细胞培养板中加入所收集到的淋巴细胞悬液，每孔加入100 μL，并设置空白对照组，浓度分别为25、50、75和100μg/mL辣椒碱的RPMI-1640完全培养液，分别加入100 μL、放于37℃、5%C02的恒温箱中培养44h，再分别加入20 μL MTT液，混匀，4h后，以1 500 r/min的转速离心15 min，弃去上清液;每孔再分别加入150 μLDMSO液，检测酶标仪于570 nm处的OD值。运用公式刺激指数一药物孔OD值/对照孔OD值，以此计算淋巴细胞的增殖效率[11]。
1.2.3 淋巴细胞分泌IFN-γ，和IL-6检测
在24孔细胞培养板中加入收集到的淋巴细胞悬液，每孔1 mL，设置空白组、浓度分别为25、50、75和100μg/mL辣椒碱组RPMI-1640培养液，各加入1 mL。然后将培养板置于恒温箱中培养48 h。离心，收集上清液，放在- 20℃环境中保存。按照ELISA试剂盒的说明书检测细胞因子IFN-γ和IL-6含量。
1.2.4 统计学分析
采用SPSS 17.0软件进行一维方差统计学分析，数据以“平均数±标准差”表示，不同罗马数字表示差异极显著“P<0.01”。
2 结果与分析
2.1 辣椒碱对脾淋巴细胞增殖的影响
不同浓度组的辣椒碱组与空白对照组相比较：不同浓度的辣椒碱组淋巴细胞的OD值均极显著（P<0.01）高于空白对照组，说明辣椒碱可以有效刺激淋巴细胞的增殖。各浓度组之间比较：浓度为50μg/mL的辣椒碱组淋巴细胞的OD值都极显著（P<0.01）高于其他质量浓度组，说明浓度为50μg/mL时，辣椒碱对刺激淋巴细胞增殖的效果优于其他浓度组，并且呈现双向调节。见图1。
2.2 辣椒碱对脾淋巴细胞分泌细胞因子的影响
不同浓度组的辣椒碱组与空白对照组相比较：不同浓度的辣椒碱组分泌IFN-γ、IL-6的量均极显著（P<0.01）高于空白对照组，说明辣椒碱可以有效刺激淋巴细胞因子IFN-γ、IL-6的分泌。各浓度组之间比较：浓度为50μg/mL的辣椒碱组淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-6的量均极显著明显高于其他浓度组，说明浓度为50μg/mL时辣椒碱对刺激淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-6的效果优于其他浓度组，并且呈现双向调节。见图2、图3。
3 讨论
淋巴细胞在免疫应答过程中起核心作用。只有接受抗原刺激后才能分化增殖，发生特异性免疫应答，产生抗体或细胞因子，称为免疫活性细胞[[12]。淋巴细胞增殖和细胞因子的分泌是评价细胞免疫功能的重要指标。白细胞介素是一类主要负责信号传递，联络白细胞群，调节细胞的活化、增殖和分化作用的细胞因子。IFN-γ又称Ⅱ型干扰素或免疫干扰素，主要由T细胞、自然杀伤细胞等淋巴细胞分泌产生，可以诱导Thl型细胞的免疫应答，具有免疫调节作用[13]。IL-6具有调节细胞生理功能，介导炎症反应，参与免疫应答和组织修复等多种生物学功能，还能增强IL-1对Th细胞的有丝分裂作用，促进T细胞增殖、分化并产生抗体，IL-6主要免疫学功能是增强其他细胞因子的效果[14]。结果表明，在一定浓度范围内，辣椒碱可以刺激淋巴细胞的增殖和细胞因子IFN-γ、IL-6的分泌，提示辣椒碱通过激活静止的T细胞使其活化，增强淋巴细胞分化增殖，发生特异性免疫应答，产生抗体或细胞因子。通过调节细胞免疫反应与体液免疫反应，进而发挥免疫增强的作用。
4 结论
辣椒碱可有效刺激脾淋巴细胞的增殖，能够促进其分泌细胞因子IFN-γ、IL-6，从而，提高辣椒碱对小鼠淋巴细胞的免疫调节活性。
参考文献
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基金項目：辽宁省自然科学基金（ 20170540369）
作者简介：王利明（1963-），男，硕士，研究方向：兽医药理学与兽医免疫学。
通信作者：李敬双（1963-），女，硕士，教授，研究方向：兽医药理学与兽医免疫学。