SSR分子标记鉴定玉米杂交种纯度的研究及应用综述
摘要：从玉米基因组DNA提取、引物的筛选、PCR反应体系优化、部分推广玉米品种纯度鉴定引物信息等方面综述了SSR分子标记在玉米杂交种纯度鉴定方面的研究及应用。
关键词：SSR；玉米；纯度鉴定；研究及应用
中图分类号：S513 文献标志码：A 文章编号：1001-1463（2018）11-0097-06
doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.11.027
Research and Application of SSR Molecular Markers to Identify Purity of Corn Hybrid
YIN Xiangjia1， HAO Nan1， NAN Ming 2， LI Shifeng 3， LI Yanmei 1， JIA Guojun 1
（1. Lanzhou Vocational and Technical College， Lanzhou Gansu 730070， China； 2.Dingxi Academy of Agricultural Sciences， Dingxi Gansu 743000， China； 3.Gansu Dunhuang Seed Co.， Ltd.， Jiuquan Gansu 735000， China）
Abstract：In this paper， the research and application of SSR molecular markers in the purity identification of corn hybrids were reviewed from the aspects of genomic DNA extraction， primer screening， PCR reaction system optimization and primer information for purity identification of some corn cultivars.
Key words：SSR； Corn； Purity identification； Research and application
玉米是重要的糧食、饲料和工业原料作物，也是我国种植面积和产量最大的作物[1 - 4 ]。据国家统计局2017年粮食产量公告[5 ]，在2017年国家继续采取调整农业种植结构，加快优化区域布局，特别是大幅度调减“镰刀弯”地区玉米播种面积的大背景下，全国粮食播种面积为1.122亿hm2，谷物播种面积0.929亿hm2，玉米播种面积为0.355亿hm2，占谷物播种面积的38.21%，占粮食播种面积的31.64%。2017年全国粮食总产量 6 179亿kg，玉米总产量2159亿kg，占粮食总产量的34.94%。作为我国第一大作物的玉米在保障国家粮食生产和安全中具有举足轻重的地位[6 ]。2016年新实施的《种子法》在原有国审和省（区）玉米品种审定制度的基础上增加了绿色通道、联合试验体以及引种备案制等，简化了玉米品种审定程序，缩短了审定时间。玉米品种是决定玉米产量和品质的决定因素。根据农业部种子管理局中国种业大数据平台显示，截至2017年，我国已有审定玉米品种8 972个，其中国审品种588个，主要集中在科研院所和种业公司[7 ]。目前我国种子企业为4 660家，注册资本在1亿元以上的种业企业有200多家，前50强种子企业的销售额达到219亿元，集中度为35.54%[8 ]，由此可见，玉米是我国种业市场份额占比较大的作物。
随着我国玉米种业市场化程度日益提高，纯度鉴定成为种子质量检测的核心指标。种子纯度是衡量种子质量的一项重要指标，对玉米产量及品质具有直接的影响。玉米种子纯度受制种基地隔离标准实施的差异性，制种过程中的去杂、去雄的及时性与彻底性，制种农户对技术规程的执行程度等综合因素的共同影响[9 ]。甘肃省已形成以河西走廊为主、以沿黄灌区和陇南为补充的全国规模最大、最具有竞争力的玉米制种基地，杂交玉米制种产量占到全国玉米制种量的60%以 上[10 ]。因此，如何快速、有效地鉴别双亲、混杂品种和真实杂交种成为品种纯度鉴定的关键[11 ]。分子标记是以DNA多态性为基础的一类遗传标记，较形态标记和生化标记具有遗传稳定好、多态性高、标记遍布整个基因组、无组织特异性而且不受外界自然环境影响等优点，在玉米基因精细定位、遗传多样性分析、划分杂种优势类群、分子标记辅助育种、指纹图谱构建、玉米种子纯度鉴定等方面都有研究和应用[12 ]。分子标记主要有限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、单核苷酸多态性（SNP）、以及基于特定引物PCR的简单序列重复（SSR）、序列特异扩增区域（SCAR）、相关序列扩增多态性（SRAP）、靶位区域扩增多态性（TRAP）等方法[13 - 14 ]。
随着SSR分子标记技术的深入研究和发展，其在玉米育种及品种纯度鉴定方面发挥着重要的作用。SSR分子标记一般由1～6个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，具有遗传多态性高、操作相对简单、重复性好、成本较低等优点，在玉米品种纯度鉴定方面有着广泛的应用[15 ]。农业部公布的玉米品种鉴定行业标准《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》（NY/T1432 — 2014）使SSR标记技术对玉米品种纯度鉴定的方法更加完善和准确[16 - 17 ]。我们从玉米基因组DNA提取、引物的筛选、PCR反应体系优化、部分推广玉米品种纯度鉴定引物信息等方面综述了SSR分子标记在玉米杂交种纯度鉴定方面的研究及应用。
1 DNA提取方法
DNA提取是SSR分子标记最基本的步骤，提取DNA的质量要满足PCR扩增反应要求， DNA的提取方法主要有SDS法、CTAB法、碱裂解法和磁珠法。
1.1 SDS法
SDS（十二烷基硫酸钠）是一种已知的能使蛋白质变性的去污剂，在核酸抽提中可破坏细胞壁及裂解核酸，在较高温度下破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。SDS法提取DNA选用的玉米材料有单粒干种子胚、叶片。高文伟等[18 ]用SDS法优化建立了玉米单粒种子胚和叶片DNA快速提取方法。李葱葱等[19 ]用SDS法借助高通量组织研磨仪建立了用于玉米叶片基因组DNA的微量快速提取方法，用高通量组织研磨仪快速研磨液氮处理过的叶片，实现了高通量提取基因组DNA的目的，提高了DNA提取的效率。
1.2 CTAB法
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中，CTAB提取液与蛋白质和多聚糖形成复合物，除去蛋白质、多糖、酚类等杂质后加入冰乙醇沉淀即可使DNA分离出来。CTAB法选用的提取玉米材料有干种子、单粒干种子胚、发芽的种子幼苗、叶片。董永军等[20 ]采用改良CTAB法，直接用全自动样品快速研磨仪研磨玉米干种子来提取DNA。李艺等[21 ]将干种子水浴后取出胚研磨后加入CTAB提取液提取DNA。李汝玉等[22 ]用改良的CTAB提取法分别从粉碎的干种子和发芽4 d的种子幼苗中提取DNA。戴军等[23 ]研究了两步CTAB法提取玉米基因组DNA作为PCR反应模版。王芳等[24 - 25 ]采用改良的CTAB法，以发芽的种子幼苗为材料提取玉米基因组DNA。由此可见，CTAB法是目前提取玉米基因组DNA比较常用和成熟的方法，再借助高通量组织研磨仪可以实现高通量的DNA提取，为玉米分子检测提供了有效的基础。
1.3 碱裂解法
碱裂解法主要用于单粒种子胚和幼芽的DNA提取，具有提取速度快，高通量的优点[26 ]。郭景伦等[27 - 28 ]分别从干种子的胚和玉米幼芽中用碱裂解法提取DNA，直接用沸水加热后加入TE缓冲液用于PCR扩增。吴向远等[29 ] 采用碱裂解法从玉米单子粒胚中快速提取了基因组DNA。闫米格 等[30 ]将干种子胚放入96 孔深孔板中，用0.1 MNaOH來提取DNA。但碱裂解法在试验过程中存在重复性和与引物的匹配性不高的情况，在引物筛选和建立PCR反应体系方面还存在一定的局限性，影响一些玉米品种纯度鉴定结果。
1.4 磁珠法
磁珠法是利用超顺磁微球颗粒表面修饰一些活性官能团，使其与核酸分子结合，在磁场作用下，可以将带有DNA分子的磁珠与溶液分离，之后通过漂洗过程除去杂质，再用TE缓冲液或者双蒸水洗脱吸附在磁珠颗粒表面的DNA。磁珠法提取玉米基因组DNA 时需要注意要提前30 min将试剂盒中保存于2～8 ℃的磁珠和洗涤液平衡至室温，将裂解液置于50 ℃水浴中溶解并摇匀。徐 潮[31 ]研究建立了磁珠法快速提取玉米基因组DNA的方法，用3种便携式提取装置替代了传统的实验室仪器。陈丽丽等[32 ]的研究结果表明，磁珠法提取玉米基因组DNA的得率最高，时间最短。此外，磁珠法提取DNA的量多，操作简便，整个提取过程可以在96孔深孔板中进行，常选用志昂生物科技有限公司普通植物DNA磁珠法提取试剂盒，借助自动提取仪器，编辑程序，实现自动化提取，但磁珠法存在DNA提取成本较高的问题。
综上所述，在玉米基因组DNA提取过程中以上4种常用方法都在使用，但是为了满足高通量的鉴定要求，大部分实验室使用高通量的组织研磨仪来代替手工研磨，以降低工作量，提高效率。采用改良的SDS法和CTAB法，选用干种子或者干种子的胚，减少提取试剂的使用量和提取步骤，也取得了良好的效果。采用碱裂解法提取玉米干种子胚DNA，既节省了发芽时间和繁琐的DNA提取时间，具有简单、快速、易操作等优点，提取的DNA质量可以满足PCR 扩增的需要。但是为了试验的准确性和重复性，同时考虑试验成本的因素，建议选用CTAB法来提取玉米基因组DNA。
2 引物的筛选
近些年玉米基因组学和生物信息学的研究与发展，为玉米SSR标记技术的广泛应用提供了一定的理论基础。Maize GDB（https：//www.maizegdb.org）中含有大量的SSR标记引物信息数据，可以直接查询数据库或者参考相关研究文献，将现有的SSR标记引物用于玉米品种纯度鉴定试验。品种纯度鉴定之前要根据具体的试验玉米品种对引物进行筛选来确定最优的SSR标记鉴定引物。王陆军等[33 ]根据前期研究的成果确定了10对核心引物，并用核心引物对18份山西省主推玉米杂交种及其自交系进行了引物筛选，得出了多态性综合表现最好的umc1590和umcl196等2对引物，可用于鉴定大部分品种的纯度。王风格等[34 ]用10对SSR引物将420份已知玉米杂交种进行DNA指纹分析，确定了bnlg161和bnlg1450等2对作为玉米杂交种纯度鉴定的首选核心引物，bnlg439、bnlg125、umc2105、umcl705和bnlg1792等5对引物作为备选核心引物，可以鉴定出412个玉米品种的纯度。由此可见，引物的筛选对检测的结果有着决定性的影响，1对引物可以检测多个品种，有时候也需要2对以上的引物来鉴定1个品种的纯度，因此，建立玉米品种的引物信息共享数据库具有重要意义。
3 PCR反应优化
在SSR分子标记鉴定玉米杂交种纯度的试验中，做好PCR反应的优化对检测结果起着重要的作用。PCR反应优化有PCR反应体系和PCR仪反应条件的优化两个方面。PCR反应体系针对玉米基因组DNA、引物、DNA聚合酶、dNTP等反应物质混合体积的组合。目前所需要的反应试剂都可以向专门的生物技术公司购买直接使用，有些公司还提供DNA聚合酶、dNTP和buffer的混合PCR反应试剂，使用的时候直接加入引物和双蒸水，可以有效缩短样品纯度检测时间。除此之外还要考虑在保证检测结果质量的基础上适当的减少反应体系的总体积，这样可以在一定程度上节约试验成本。王士磊等[35 ]对玉米SSR-PCR体系从模板DNA、dNTP、引物、DNA聚合酶浓度4种因素4个水平进行优化分析，并对退火温度进行梯度试验，建立了10 μL的高效、实用、稳定的反应体系。PCR反应优化要建立在高度的可重性的基础上，减少检测试验的成本，以最少的体系量和最佳的PCR反应程序来得出准确的结果。
4 部分推广玉米品种纯度鉴定引物信息
现将文献报道和在MaizeGDB中补充查询到的部分推广玉米品种的纯度鉴定所需要SSR标记引物信息进行了汇总（表1）[36 - 51 ]，供相关领域的研究人员提供参考。
5 结束语
SSR分子标记应用于鉴定玉米品种纯度，大大缩短了种子纯度的检测时间，及时确定不同玉米品种种子质量，防止不合格种子播种，对保护农户种植利益、玉米生产安全，促进农业发展和农村社会稳定起到了积极的促进作用。主要表现在以下三个层面。第一个层面是玉米种业企业可以利用SSR分子标记技术准确快速检测玉米种子的纯度，保证种子的真实性，这样可以建立起玉米种业企业的制种质量监控体系，有效促进玉米田间制种技术规程的使用效果，严格做好去杂和去雄的工作。SSR标记可以非常有效地将品种亲本自交系进行区别，为了提高检测结果的准确性，还可以通过多对标记引物逐一对同一样品进行鉴定，或者利用多重PCR将多对引物混合起来进行纯度鉴定。第二个层面主要是国家农业农村部植物新品種保护办公室在受理玉米新品种保护时，利用SSR分子标记技术做好DUS测试的部分内容，给申请品种一个身份权利保护标识，防止该玉米品种被其他品种冒充，对玉米新品种加强保护的效力。第三个层面是每年各级种子管理部门的春季种子市场执法检查，其中主要是对品种的真实性和种子纯度进行检查和检测，以此来保护农户的合法权益，维护玉米生产安全。
随着SSR分子标记技术与信息技术的结合，如何有效建立快速鉴定农作物品种纯度和真实性的方法，使得玉米品种纯度的鉴定可以在植株任何生长阶段都能快速进行成为了新的研究课题。同时还要利用互联网技术，在国家主管部门的指导下，实现试验数据在不同实验室和不同企事业单位之间的共享，有效的打击玉米假冒伪劣品种，提高玉米种子的供应质量，促进我国农作物品种产业健康稳定的发展。随着分子生物学的不断发展，今后将涌现许多更有效的新型分子标记，还要将SSR分子标记技术进一步改良与完善，开发新型SSR-PCR结果读取仪器，做到智能化和高通量，提高玉米种子纯度的检测质量和效率。只有这样，SSR分子标记技术才能为玉米种子纯度的高效检测和建立玉米种业产业的信息化质量监控体系提供技术支撑。
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（本文责编：郑立龙）