EZH2,shRNA对肾癌ACHN细胞增殖、凋亡及mTOR信号通路的影响
[摘要] 目的 探討干扰沉默EZH2基因对肾癌ACHN细胞细胞株的增殖、凋亡及 mTOR信号通路的影响。 方法 设计针对EZH2基因干扰RNA（shRNA），经脂质体将转染EZH2 shRNA入肾癌ACHN细胞，应用RQ-PCR 及 Western blot 鉴定其干扰效果，MTT法绘制细胞生长曲线，TUNEL检测细胞凋亡的变化，Western blot 检测组蛋白H3K27三甲基化水平（H3K27me3），凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Procaspase-3及mTOR信号通路蛋白mTOR、磷酸化mTOR蛋白（p-mTOR）、磷酸化P70核糖体蛋白S6激酶（phosphorylation P70 ribosomal protein S6 kinase，p-P70S6K）的变化。结果 EZH2 shRNA转染ACHN细胞48 h后，EZH2的 mRNA 和蛋白表达均明显下降，差异有统计学意义（P<0.05），EZH2 shRNA组细胞增殖率明显低于 Neg shRNA 组和Control组（P<0.05），EZH2 shRNA组细胞的凋亡率为（45.57±5.26）%，而Neg shRNA 组和Control组分别为（3.24±1.37）%、（1.65±0.94）%，差异有统计学意义（F=48.62，P<0.05）。促进凋亡蛋白Bax表达增强，凋亡抑制蛋白Bcl-2表达减弱，凋亡执行蛋白前体Procaspase3减少。H3K27me3水平较Control组明显下降，而检测mTOR通路蛋白发现mTOR总蛋白未见明显下降，但是活性形式的磷酸化p-mTOR、p-P70S6K表达下降。结论 干扰沉默EZH2基因可抑制肾癌ACHN细胞增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能是调节组蛋白H3K27me3水平变化，特异性抑制mTOR信号通路的活性。
[关键词] EZH2；H3K27me3；肾癌；RNA干扰mTOR信号通路
[中图分类号] R5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）12（c）-0001-05
[Abstract] Objective This paper tries to investigate the effect of silencing EZH2 geneon the proliferation， apoptosis andmTOR signalpathway in ACHN human renal cell carcinoma cells. Methods The interference of RNA （shRNA）aiming at EZH2 gene was designed， and EZH2 shRNA were transfected into ACHNhuman renal cell carcinoma cells through lipidosome. The interference effects were identified by RQ-PCR and Western blot， and cell growth curve was drawn by MTT method. Changes in apoptosiswere detected by TUNEL， and the histone H3K27 trimethylation level （H3K27me3）， changes in apoptosis related proteins Bcl-2， Bax and Procaspase-3， mTOR signalpathway proteins mTOR， phosphorylated mTOR protein （p-mTOR） and phosphorylation P70 ribosomal protein S6 kinase （p-P70S6K） were detected by Western blot. Results The mRNA and protein of EZH2 were markedly decreased at 48 h after EZH2 shRNA being transfected into ACHN human renal cell carcinoma cells（P<0.05）. The cell proliferation rate in EZH2 shRNA group was significantly lower than that in Neg shRNA group and Control group （P<0.05）. The cell apoptosis rate inEZH2shRNA group was （45.57±5.26）%， while the rate in Neg shRNA group and Control group were （3.24±1.37）% and （1.65±0.94）%， respectively （F=48.62， P<0.05）. The expression of protein Baxpromoting apoptosiswas increased， the expression of Bcl-2 inhibiting apoptosis was weakened， and the apoptosis precursor protein Procaspase3 was decreased. The level of H3K27me3 was significantly lower than that in control group while the detection of mTOR pathway protein showed that the total protein of mTOR was not decrease significantly. Besides， the expression of phosphorylated p-mTOR and p-P70S6K in active forms was decreased. Conclusion Silencing EZH2 gene can inhibit the proliferation and induce apoptosis of ACHN human renal cell carcinoma cells， and the mechanism may be regulatingchanges in the level of histone H3K27me3 and specifically inhibiting the activity of mTOR signaling pathway.
[Key words] EZH2； H3K27me3； Renal cell carcinoma； RNA interference mTOR singalpathway
肾癌是泌尿系统常见的肿瘤之一，我国泌尿生殖系恶性肿瘤中占第2位，发病率仅次于膀胱癌。但对于肾癌的發生、发展、侵袭转移的确切的分子机制尚未完全清楚。目前多项研究证实，表观遗传学修饰异常是恶性肿瘤发生、发展、侵袭转移的重要原因之一[1]。EZH2（Enhancer of Zeste Homolog 2）基因是果蝇 E（z）在人类的同源基因，EZH2基因是PcG（Polycomb group）基因家族的重要成员之一，特异性完成H3K27三甲基化修饰。EZH2在多种肿瘤组织中高表达，与肿瘤的进展及预后相关[2-3]。该次实验通过shRNA干扰沉默人肾癌ACHN细胞EZH2基因，观察其对ACHN细胞和mTOR信号通路的影响，以寻求EZH2基因在肾癌靶向治疗中的可能性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验细胞株来自科学院上海细胞库，RPMI-1640培养基、胎牛血清来自美国Gibico公司，RNA提取试剂盒、RQ-PCR试剂盒、TUNNEL试剂盒、Lipofectamine 2000均购自美国Invitrogen公司，MTT（浓度为5 mg/mL）及二甲基亚砜均购自美国Sigma公司，EZH2、三甲基化H3K27（H3K27me3）一抗购自美国Upstate公司。Bcl-2、Bax、Procaspase-3、mTOR、磷酸化mTOR蛋白（p-mTOR）、磷酸化P70核糖体蛋白S6激酶（phosphorylation P70 ribosomal protein S6 kinase，p-P70S6K）、β-actin、二抗及蛋白印迹法化学发光工作液都购自美国Santa Cruz 公司。
针对EZH2区域选择相应的作用靶点，合成针对EZH2核心编码区461-481bp结构为靶向的核苷酸片段（核苷酸序列为AAGACTCTGAATGCAGTTGCT）。委托上海吉玛制药技术有限公司合成EZH2 shRNA，同时购买阴性shRNA（Neg shRNA）。PCR引物均由上海吉玛制药技术有限公司合成。
1.2 试验方法
细胞培养：在体积分数5%饱和湿度的CO2培养箱中使用含15%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养ACHN细胞株，培养箱温度控制在37℃，每间隔1 d更换1次液体，传代培养，选取对数生长期细胞进行实验。
细胞转染：将lipofectamineTM2000、Neg shRNA、EZH2 shRNA均使用Opti-MEM培养基稀释，分别得到A液、B液、C液，将A液于室温下放置5 min，再与C液混合并在室温放置20 min使形成转染复合物0.5 mL，将转染复合物置于无抗培养基（含细胞）中，使终体积为2 mL，把细胞置于体积分数为5%的CO2培养箱中培养48 h，培养箱温度控制在37℃，之后收集细胞，检测EZH2 mRNA表达水平。
RT-PCR检测EZH2 mRNA表达：按照Trizol说明书步骤提取总RNA，采用分光光度法检测RNA浓度及纯度，A260/A280比值介于1.8～2.0之间，逆转录为cDNA，PCR引物序列：EZH2上游引物5′-TTG TTG GCG GAA GCG TGT AAA ATC-3，下游引物5′-TCC CTA GTC CCG CGC AAT GAG C-3；β-actin上游引物5′-CTC GTC ATA CTC CTG CTT GCT-3′，下游引物5′-CGG GAC CTG ACT GAC TAC CTC-3′。2-ΔΔCt计算检测基因mRNA相应表达量，每组各测3次，取平均值。
EZH2 shRNA对ACHN细胞增殖的影响：选择对数生长期细胞，调整其浓度为1.0×105/mL，并接种于96孔细胞培养板（Costar）中，每孔100 μL，实验分3组： Control组、 Neg shRNA 组、EZH2 shRNA 组，同时设立空白组（只加培养液），每组设8个平行孔，培养48 h后，每孔加20 μL MTT，再培养4 h，离心，分离上清液，向每孔加150 μL二甲基亚砜并震荡，充分溶解结晶物，在酶标仪上用双波长492 nm和630 nm测吸光度（OD值）。细胞增殖率（%）=（OD实验-OD空白）/（OD对照-OD空白）×100%。上述步骤重复 3 次，细胞增殖率取平均值。EZH2 shRNA对ACHN细胞凋亡的影响实验分3组：Control组、Neg shRNA 组、EZH2 shRNA 组，培养48 h后收集细胞。按TUNEL试剂盒说明书操作方法，计数5个视野，每个视野计数200个细胞，计算细胞的凋亡率。
EZH2 shRNA对ACHN细胞凋亡相关蛋白及对mTOR信号通路相关蛋白的影响：将作用24 h后的细胞预冷PBS离心洗涤两次，吸干。根据 1×106 细胞加入 100 μL 裂解液+1 μL酶抑制剂的比例冰上裂解细胞30 min，置于4℃条件下离心10 min， 10 000×g，去掉上层清液，取中间清亮层进行蛋白定量（BCA法）后用12%的SDS-PAGE进行电泳分离再转膜，于室温下摇床封闭1 h，加入用TBS（浓度根据一抗稀释）并置于4℃环境下过夜，使用TBS洗涤液洗膜，并将其分别置于TBS稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（1∶5 000），进行1 h摇床作用，洗膜（TBS）后使用化学发光法显色，X射线底片曝光，将β-actin作为内参照，扫描结束后使用AlphaDigiDoc 图像分析软件进行分析。
1.3 统计方法
数据分析用SPSS 20.0统计学软件处理，检验方差齐性，计量资料以（x±s）表示，以单因素方差分析进行组间比较，P﹤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 EZH2 shRNA下调ACHN细胞EZH2 mRNA、EZH2蛋白表达
EZH2 shRNA处理ACHN细胞48 h后，使用RQ-PCR检测EZH2 mRNA的变化，EZH2 shRNA组：（0.137±0.042），Neg shRNA组：（0.988±0.124），Control组：（1.108±0.095），EZH2 shRNA组与Control组差异有统计学意义（n=3，P<0.05），Neg-shRNA组与Control组差异无统计学意义（n=3，P>0.05）（图1）；Western blot检测EZH2蛋白的变化，EZH2 shRNA组：（0.102±0.015），Neg shRNA组：（1.108±0.074），Control组：（1.139±0.058），EZH2 shRNA组与Control组差异有统计学意义（n=3，P<0.05），Neg-shRNA组与Control组差异无统计学意义（n=3，P>0.05） （图5）。
2.2 EZH2 shRNA抑制ACHN细胞增殖
Control组为在48 h细胞的增殖率为（97.24±1.37）% ，Neg shRNA 组在48 h细胞的增殖率为（95.65±1.29）%，两组间比较差异无统计学意义（P>0.05），EZH2 shRNA组细胞增殖（43.83±2.42）%较Control组和Neg shRNA 组明显较低，差异有统计学意义（P<0.05），表明EZH2 shRNA有效抑制ACHN细胞增殖的能力（图2）。
2.3 EZH2 shRNA诱导ACHN细胞凋亡
EZH2 shRNA处理ACHN细细胞48 h后，EZH2 shRNA组细胞的凋亡率为（45.57±5.26）%，而Neg shRNA 组和Control组分别为（3.24±1.37）%、（1.65±0.94）%，差异有统计学意义（F=48.62，P<0.05）（图3） 。
2.4 EZH2 shRNA上调ACHN细胞的Bax蛋白，下调Bcl-2、Procaspase3 的表达
48 h后Bax表达相较之前明显增加，Bcl-2表达明显减弱，Procaspase3明显减少，细胞凋亡发生（图4）。
2.5 EZH2 shRNA下调ACHN细胞H3K27me3及mTOR通路的磷酸化水平
EZH2 shRNA干扰沉默EZH2基因表达48 h后，Western blot检测发现ACHN细胞组蛋白H3K27me3水平较Control组明显下降，而检测mTOR通路蛋白发现mTOR总蛋白未见明显下降，但是活性形式的磷酸化p-mTOR、p-P70S6K表达下降，提示EZH2 shRNA可以以去磷酸化形式抑制mTOR通路（图5）。
3 讨论
EZH2（enhancer of zeste homolog 2）是果蝇 E（z）基因、小鼠Ezh1和Ezh2基因在人类的同源物，是PcG家族中 PRC2 蛋白复合物的催化活性部位。本基因在进化上保守程度高，N端含3个与果蝇 E（z）基因高度同源的序列，C端包含一高度进化保守的SET结构域，该结构域与染色体相关的基因表达相关紧密，是EZH2基因介导转录抑制不可或缺的部分，如果本结构域丢失的话就不会产生抑制表现，甚至在某些情况下可能使基因去抑制化[4]。EZH2的SET结构域具有组蛋白甲基转移酶的活性，可以对核小体组蛋白H3的27位赖氨酸进行三甲基化修饰，三甲基化后的H3K27（H3K27me3）可以将PRC2复合物招募到特定的基因位点，抑制靶基因的转录[5]，这些靶基因中包含一些肿瘤抑制基因，它们在细胞周期调节、细胞分化、衰老、肿瘤发生等方面发挥重要作用[6]。
近年来研究显示，多种恶性肿瘤均发现EZH2过量表达，但在良性肿瘤中并未发现这种情况，表示EZH2的异常表达可以作为区分良性肿瘤和恶性肿瘤的标记之一[7]。Kleer 等[8]发现乳腺癌的EZH2蛋白水平与乳腺癌侵袭性高度相关，并且对患者的预后与 EZH2 的表达关系进行分析，EZH2 与肿瘤大小、分期、淋巴结转移呈正相关，是乳腺癌的独立预后因素。 EZH2 异常高表达，可以促进乳腺癌细胞增殖和侵袭转移，患者预后差且复发率高[8]。EZH2与泌尿系肿瘤的发生、发展也密切相关。在膀胱癌组织EZH2 表达水平随着肿瘤分级分期的提高而增加，且高表达者复发时间缩短，为预后不良指标。EZH2在转移性前列腺癌的组织表达水平较良性或临床局限性病变显著升高，且与前列腺癌患者的不良预后密切相关。下调 EZH2 蛋白可抑制前列腺癌细胞生长，阻滞细胞周期在 G2/M 期[10]。肾癌组织中，EZH2表达明显较高，且EZH2表达水平与肿瘤分期、病理分级等均呈正相关，EZH2表达阳性的患者术后5年生存率较差[11]。使用 siRNA技术干扰沉默肾癌769-P细胞中EZH2基因的表达，发现可以抑制肿瘤细胞的增殖能力，使细胞周期阻滞在G0/G1期[12]。
该次研究也发现EZH2 shRNA能明显下调ACHN细胞EZH2 mRNA、EZH2蛋白表达，EZH2 shRNA转染细胞48 h后细胞增殖率为（43.83±2.42）%，顯著低于Control组的（97.24±1.37）% 和Neg shRNA 组的（95.65±1.29）%，EZH2 shRNA可有效抑制Jeko-1细胞增殖能力。进一步使用Western blot检测发现Bax表达增加，Bcl-2表达减弱，Procaspase3减少，EZH2 shRNA组的细胞凋亡率为（45.57±5.26）%，显著高于Neg shRNA 组和Control组的（3.24±1.37）%、（1.65±0.94）%，差异有统计学意义（F=48.62，P<0.01），证实EZH2 shRNA可以诱导细胞的凋亡。
mTOR信号通路作为细胞内重要的信号转导途径之一，在肿瘤细胞的发生发展过程中起到重要作用。本项研究表明，mTOR信号途径异常激活可以导致肾癌细胞抗凋亡能力、细胞增殖、肿瘤的侵袭和转移能力增强。通过信号抑制剂阻断mTOR效应分子活化、促进细胞凋亡已经成为治疗肾癌的新思路[13-14]。mTOR信号通路活性受到组蛋白甲基化水平的调节，在体外沉默前列腺癌的组蛋白甲基化酶SMYD基因后，发现mTOR信号通路出现抑制，细胞增殖受限细胞，凋亡增加[15]。该次研究也发现EZH2基因表达下降后，H3K27me3水平明显下降， mTOR总蛋白未见明显下降，但是活性形式的磷酸化p-mTOR、p-P70S6K表达下降，表明EZH2 shRNA可以以去磷酸化形式抑制mTOR通路。
综上所述，干扰沉默EZH2基因后，调节组蛋白H3K27me3的水平，抑制mTOR信号通路活性，肾癌ACHN细胞增殖能力下降，细胞凋亡增加，提示以EZH2作为抗肿瘤靶点的研究具有良好的应用前景
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（收稿日期：2017-09-21）