丹酚酸A逆转肺癌多药耐药基因MDR1相关microRNA的筛选与鉴定
材料
人肺癌A549细胞株购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。丹酚酸A（上海友思生物技术有限公司，批号100118）；DMEM（Gibco，批号11995-065）；澳洲进口胎牛血清（Gibco，批号 16000-044）；青-链霉素（Gibco，批号 15140-122）；0.25%胰蛋白酶（Gibco，批号 25200-056）；Trizol（TaKaRa，批号A9501-1）；逆转录试剂盒（TaKaRa，批号AK3901）；microRNA逆转录试剂盒（Vazyme，批号 807051）；RT-PCR试剂盒（TaKaRa，批号RR820A）。
超净工作台（SW-CJ-1FD，苏州净化设备有限公司）；CO2恒温培养箱（NU4950E，美国 NUAIRE公司）；倒置相差显微镜（DFC-259，德国 Leica公司）；实时定量荧光PCR（Step one，美国ABI公司）。
2 方法
2.1 细胞样本处理及RNA抽提 将人肺癌A549细胞与终浓度为40 mg·L-1（本实验室前期筛选出40 mg·L-1的丹酚酸A作用24 h的抗肿瘤效果最好）的丹酚酸A和对照组的培养液作用24 h后，从培养皿中吸出并弃去培养液，收集对照组和给药组细胞，采用传统的Trizol法提取细胞的总RNA 。
2.2 实时定量PCR检测mRNA表达 按照TaKaRa公司提供的逆转录试剂盒说明书及Real-time PCR试剂盒说明书，将RNA逆转录成cDNA，在实时荧光定量PCR仪上进行目标基因的检测，其中引物是Primer Premier 5.0软件设计并由南京金斯瑞生物有限公司合成，引物序列见表1。
2.3 microRNA芯片中RNA的提取和纯化 收集对照组和给药组细胞，采用Trizol （TaKaRa）和 miRNeasy mini kit （QIAGEN）并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行总 RNA 提取，提取所得总 RNA 经 Agilent Bioana-lyzer 电泳质检。
2.4 microRNA芯片检测上述2组细胞的 microRNA 表达谱 本实验采用Exiqon miRCURYTM LNA Array （v.18.0）芯片，由上海康成生物工程有限公司代理完成检测和分析。将提取合格的样品用miRCURYTM Hy3TM/Hy5TM Power labeling kit 对样品中的miRNA 分子进行荧光标记，随后放入滚动杂交炉，55 ℃，20 r·min-1滚动杂交 20 h。杂交完成后再洗缸中洗片。芯片结果采用the Axon GenePix 4000B microarray scanner进行扫描，用GenePix Pro 6.0 software （Axon）读取数据，最后采用 Gene Spring Software 11.0 进行归一化处理，所用算法为 Quantile。差异表达的 miRNA 筛选标准：①2种细胞信号 ratio≥2 为上调 miRNA；②信号 ratio≤0.5 为下调。
2.5 靶miRNA预测 由于给药组多药耐药基因MDR1表达水平下调，选取差异表达谱中上调的miRNA，以MDR1为靶基因用Targetscan（http：//www.targetscan.org/）预测与MDR1相关的miRNA。
2.6 实时定量 PCR验证筛选出的miRNA 收集对照组和给药组细胞，采用传统的Trizol法提取细胞的总RNA；运用颈环引物法，按照诺唯赞生物公司提供的microRNA逆转录试剂盒说明书，将RNA逆转录成cDNA，Real-time PCR反应体系为：SYBR@ Premix Ex TaqTMⅡ5 μL，上下游引物（引物序列见表2，浓度为10 μmol·L-1）各0.5 μL，cDNA 0.2 μL，加双蒸水至总反应体积为10 μL。每份样品均做3个复孔。反应条件为95 ℃ 2 min，95 ℃15 s，60 ℃45 s，共40个循环。
2.7 统计学处理 利用SPSS 15.0统计软件对实验数据进行统计学处理，计量资料采用±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD 检验，P<0.05或P<0.01表示差异具有统计学意义。
3 结果与分析
3.1 实时定量PCR检测MDR1表达水平 采用40 mg·L-1的丹酚酸A处理人肺癌A549细胞，24 h后收集细胞，RT-PCR检测对照组和给药组的MDR1基因，结果见图1。丹酚酸A能明显下调MDR1基因的表达水平，且与对照组比较，差异具有明显统计学意义（P<0.01）。
3.2 芯片样品RNA 质检结果 本研究选取了3个对照组样本和3个给药组样本进行芯片实验，提取所得总 RNA 经 Agilent Bioana-lyzer 电泳质检合格，见图2。电泳结果可见 3 条电泳条带，其中上面2条带分别为 28S 和 18S 核糖体 RNA，最下面的一条为更小稍微扩散的条带，由低相对分子质量的 t RNA 和 SS 核糖体 RNA。图中可见 28S 和 18S 的2条条带亮而浓，且 28S 条带的密度约为 18S 条带的 2 倍，提示组织 RNA 完整性较好，能够满足芯片实验及 RT-PCR 实验的需要。
3.3 对照组与给药组miRNA差异筛选 按照实验设计中的差异显著阳性的标准比较方法，以Test/ Control ≥2或≤0.5作为差异表达点，≥2为上调miRNA，≤0.5为下调miRNAs。 在检测的2组细胞中，Test/Control ≥2的miRNA共有106个，占差异miRNA总数的24.88% ；Test/Control ≤0.5的miRNA共有320个，占差异miRNA总数的75.12%。
3.4 差异表达miRNA靶基因预测 为了更进一步地了解差异表达上调的miRNA哪些可能参与下调多药耐药基因MDR1发挥多药耐药的机制，本研究采用Targetscan软件对芯片筛选上调的miRNA进行了靶基因预测。4个明显差异上调表达的miRNA与多药耐药基因MDR1相关，见图3，表3。
3.5 实时定量PCR验证筛选出的miRNA 将上一步中筛选出的4个miRNA：miR-3686，miR-4708-3p，miR-4738-3p，miR-3667-5p从表达上调的miRNA中挑选出，用茎环引物法对其进行逆转并用特异引物进行扩增，同时以U6作为内参。验证结果显示这4个miRNA在给药组细胞中表达显著上调（P<0.01），见图4。实时定量PCR结果显示与microRNA芯片结果具有较好的一致性。
4 讨论
多药耐药（MDR） 是由 Bieder 和Richm 1970 年第一次提出，是指肿瘤使用一种化疗药物产生耐药后，同时对其他未应用过的、药物结构和作用机制各异的数种抗肿瘤药物也具有交叉耐药[6]。据美国癌症协会调查发现，每年死于肿瘤的患者超过 90%与耐药相关。目前如何增加肿瘤患者化疗疗效，如何有效逆转肿瘤多药耐药，是当前肿瘤方向研究领域中的热点和难点，也是科学研究人员亟待解决的重大问题[6]。中药具有多组/成分，多途径、多靶点作用等特点，可以作用于肿瘤MDR的多种机制，近年来成为应对肿瘤MDR的重要来源[7]。目前国内外许多学者的研究方向转向了中药，以期从中药中寻找出高效、低毒、作用靶点广泛的肿瘤耐药逆转剂。丹酚酸A拥有广泛的药理活性，在心血管疾病、肿瘤等疾病上表现出较好的防治效果。而多药耐药作为肿瘤治疗的一个难题，丹酚酸A对其是否有逆转作用以及逆转机制仍有待研究。
microRNAs（miRNAs）是一类长约 22 nt 的非编码的单链 RNA 分子，广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中，可通过碱基配对的方式结合靶 mRNA 的 3′非翻译区（3′-UTR），从而抑制其翻译。miRNA 作为一类主要通过抑制mRNA 翻译和表达的非编码 RNA，在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用[8-9]。研究表明 miRNA 能够通过影响多种耐药相关蛋白来影响肿瘤的耐药表型，甚至可以逆转耐药表型[10-11]。另有研究发现microRNA家族中的miR-27a和miR-451在MDR肿瘤细胞中的表达具有差异性，miR-27a 和 miR-451 与 P-gp 蛋白的表达相关，导致肿瘤细胞产生耐药性[12]。因此，miRNA在肿瘤多药耐药中可能通过调控靶基因的表达来影响肿瘤细胞的耐药性。
ABCB1，又名 P-糖蛋白 （P-glycoprotein，P-gp），1976 年 Juliano等在中国仓鼠卵母细胞中发现，由多药耐药基因 MDR1（multidrug resistance 1）所编码。P-gp 是一种能量依赖性药物外排泵，它既可以与一些抗肿瘤药物结合，又可以与ATP 结合，因此 P-gp 一旦与抗肿瘤药物结合后，即可通过 ATP 水解提供能量，将抗肿瘤药物泵出细胞外，致使细胞内药物的浓度降低，细胞毒性减弱或完全消失，从而产生耐药性[13]。李莉等[14]在研究人喉癌紫杉醇耐药细胞株的耐药机制认为 MDR 是由于 P-gp表达升高，使细胞内药物逐渐泵出细胞外，进而产生多药耐药性。
在本研究中，首先用实时定量PCR检测出对人肺癌A549细胞给予40 mg·L-1丹酚酸A 24 h后MDR1基因的表达明显下调；应用最新的全基因组microRNA芯片对人肺癌A549细胞的给药组和对照组进行了miRNA表达谱分析，共筛出426个差异表达的miRNA。然后对差异表达上调的miRNA进行靶基因预测，发现有4个明显上调的miRNA与MDR1基因相关。对4个miRNA进行实时定量PCR验证，实时定量PCR证实了芯片结果的可靠性。综上所述，本研究提示，一定浓度的丹酚酸A可以使多药耐药基因MDR1表达下调，另外可以使相关miRNA上调，这可能是由于丹酚酸A作用肿瘤细胞后上调miRNA进而调控其靶基因MDR1，对进一步研究丹酚酸A逆转多药耐药的作用机制提供了实验依据。
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[责任编辑 马超一]