人参皂苷Rh2促进K562细胞自噬凋亡的体内实验研究
材料
人白血病K562细胞株受赠于重庆医科大学检验系，由本室传代保种。用10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中常规培养，每2～3 d传代1次。
SPF级Balb/c无胸腺小鼠，雌性，5周龄，15只，购于重庆医科大学动物实验中心，动物合格证号SCXX（京）2014-0004。
人参皂苷单体Rh2（S）购自成都曼斯特生物科技有限公司（纯度98%），取1 mL PBS加入10 mg Rh2（S） 使之充分溶解，配制成10 g·mL-1的储存液，-20 ℃保存。细胞胞浆胞核提取试剂盒（K266），HAT（K332），HDAC （K331）检测试剂盒购自美国BioVision公司； PVDF膜和ECL发光液购自美国Millpore公司；RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自以色列Bioind公司；甘氨酸，Trisbase，SDS购自美国Genview公司；Histone Deacetylase Antibody Sampler Kit （9928） 购自美国Cell Signaling Technology公司；Hsp90单克隆抗体购自美国BD公司；cleaved caspase-3，β-actin单克隆抗体，辣根标记山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG二抗购于碧云天生物技术研究所；免疫组化试剂盒购自北京中衫金桥公司。
MCV-B161S（T）超净工作台（Sanyo公司）；CKX41倒置显微镜（Olympus公司）；BS124S 型电子天平（Sartorius公司）；低温离心机（Sigma公司）；酶标仪，垂直电泳仪，电转仪，ChemiDocXRS化学发光成像系统，PCR仪（Bio-Rad公司）；二氧化碳培养箱（Thermo公司）。
2 方法
2.1 人白血病裸鼠异体移植瘤模型的建立 5周龄雄性无胸腺Balb/c小鼠，腹腔注射环磷酰胺3 d后，取在对数生长期的K562细胞，用无血清RPMI 1640 培养基制备成1×108个/mL的细胞悬液，用微量注射器注射0.15 mL在裸鼠右后臀部皮下，待裸鼠移植成瘤，建立人白血病K562裸鼠异体移植瘤模型，当瘤体直径到0.8 cm后，视为模型建立成功（模型组为对照组）。
2.2 分组及给药方法 所有动物随机分为对照组（灌胃生理盐水），人参皂苷Rh2（20 mg·kg-1）组，每组5只动物，各组灌胃给药，给药体积均为0.2 mL，每天1次，连续给药21 d。
2.3 肿瘤体积和抑瘤率的测定 各组给药后每天用游标卡尺测量动物的瘤长（a）和瘤宽（b），计算瘤体积（V=1/2a×b2）。实验结束时，完整剥取瘤块，称瘤质量，计算抑瘤率 [抑瘤率=（模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量） /模型组平均瘤质量×100%]，拍照，液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存备用。
2.4 瘤组织中HDAC和HAT活性的影响 取部分瘤块，称质量30 mg，剪碎，匀浆后用预冷PBS漂洗，按照Nuclear/Cytosol Fractionation Kit（BioVision， K266-100）试剂盒说明提取核蛋白，BCA法测得各组蛋白浓度，取50 μg待测蛋白样品，并分别按照HDAC和HAT的说明操作，最后分别得到415，450 nm波长处的吸光度（A），实验重复3次。
2.5 瘤组织中HDAC蛋白表达的检测 称取100 g肿瘤组织，提取蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入1∶2 000稀释的抗HDAC1-6和β-actin抗体，4 ℃孵育过夜；用TBST漂洗后，分别加入稀释度均为1∶1 000的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）和辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG（H+L）室温孵育1.5 h，经TBST漂洗，最后用显色剂ECL化学发光，图像分析软件Quantity One半定量分析特定条带的吸光度，并以目的条带与内参的吸光度之比作为目的蛋白的相对表达水平，实验重复3次。
2.6 Real-time PCR 检测基因表达 参照试剂盒说明书进行，TRIzol提取肿瘤组织总RNA。采用TaKaRa反转录酶试剂盒逆转录cDNA。应用TaKaRa的SYBRⅡ试剂，PCR反应体系为10检测HDAC6，Hsp90，beclin-1，LC3A，LC3B的mRNA 水平，引物序列见表1。以GAPDH为内参基因，用目的基因与GAPDH 的起始拷贝数比值表示目的基因的相对表达量，实验重复3次。
2.7 病理学检测 制作瘤块石蜡切片（5 μm），HE染色观察细胞形态，按中杉金桥免疫组化试剂盒（SP-9000）说明书进行染色，一抗caspase 3（1∶150），HDAC6和Hsp90（1∶200），二抗山羊抗兔（1∶100）用苏木精复染，封片后置于显微镜下400倍拍照（Olympus）。
2.8 统计学处理 使用SPSS 17.0软件进行统计分析，所有数据用±s表示，多组均数间比较用两因素和单因素方差分析，组间两两比较用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 对荷瘤裸鼠移植瘤生长的影响 20 mg·kg-1人参皂苷Rh2给药第15天后，肿瘤体积明显下降，与模型组比较差异显著（P<0.05），见图1，2。人参皂苷Rh2组的瘤体质量较模型组下降，与模型组比较差异显著（P<0.05），抑瘤率为53.10%，见表2。结果表明，人参皂苷Rh2具有明显抑瘤作用。
3.2 对荷瘤裸鼠瘤组织中HAT和HDAC活性的影响 化学发光法检测显示灌胃人参皂苷Rh2的瘤组织中HAT酶活性水平均有上升，但其升高程度没有
统计学意义；然而灌胃人参皂苷Rh2的瘤组织中HDAC酶活性下降，并与模型组比较差异显著（P<0.05），见表3，说明人参皂苷Rh2能降低肿瘤的HDAC酶活性。
3.3 对荷瘤裸鼠瘤组织HDAC蛋白表达的影响 采用免疫印迹法检测各组瘤组织HDAC蛋白表达的变化，结果表明，灌胃人参皂苷Rh2组HDAC1，HDAC2，HDAC6蛋白表达明显下调，其中HDAC6下调更为明显，与模型组比较差异显著（P<0.05）；HDAC3，HDAC4蛋白表达无明显变化，与模型组比较差异无显著意义，K562细胞中HDAC5几乎不表达，与文献报道一致，见图3。
3.4 Real-time PCR检测瘤组织中自噬通路基因的表达 通过实时荧光定量PCR 检测，本实验发现人参皂苷Rh2组裸鼠瘤组织的HDAC6和Hsp90表达明显下调，与模型组比较差异显著（P<0.05）。人参皂苷Rh2组裸鼠瘤组织自噬的重要相关基因beclin-1，LC3A和LC3B表达明显上调，与模型组比较差异显著（P<0.05），见图4。结果表明，在体内人参皂苷Rh2可能通过降低HHDAC6促进K562细胞发生自噬。
3.5 组织病理学检测瘤组织中凋亡通路基因的表达 将瘤组织制作成瘤块石蜡切片（5 μm），HE染色观察，灌胃人参皂苷Rh2组与模型组比较细胞形态不规则，胞浆红染，胞核变小，核桨比减小。免疫组化的结果显示用药组的激活型caspase 3表达升高。结果说明灌胃人参皂苷Rh2后，肿瘤细胞凋亡增加。为了研究HDAC6对凋亡通路的影响，本实验用免疫组化检测HDAC6和Hsp90的表达，结果显示灌胃人参皂苷Rh2后，与模型组作比较，HDAC6和Hsp90的表达明显减少，见图5。结果表明，在体内人参皂苷Rh2可能通过降低HHDAC6促进K562细胞发生凋亡。
4 讨论
本研究结果表明，人参皂苷Rh2能明显抑制人白血病K562细胞裸鼠异体移植瘤的生长，其剂量为20 mg·kg-1时抑瘤率可达53.10%，在体内具有较好抗肿瘤作用。本课题组前期体外实验研究表明，人参皂苷Rh2在体外也能抑制白血病细胞增殖[7]。因此，作为一种新型抗肿瘤中药，人参皂苷Rh2具有较高的药用价值。
组蛋白和非组蛋白可逆性的乙酰化修饰是由组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶可逆性调节的结果[8]；组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的过表达会引起蛋白乙酰化作用增强，会导致肿瘤的发生发展[9]。因此，HDAC可作为肿瘤治疗的靶点[10]。前期在体外实验也证明了人参皂苷Rh2能够抑制HDAC酶的活性和提高HAT酶的活性，降低HDAC1，HDAC2，HDAC6的表达[7]。因此，在体内外实验证明人参皂苷Rh2能够抑制HDAC酶的活性，降低HDAC1，HDAC2，HDAC6的表达。由此可以推断人参皂苷Rh2可以从组蛋白去乙酰化酶抑制白血病细胞增殖，达到治疗白血病的效果。
自噬是指自噬相关基因调节的，进化上高度保守的溶酶体降解过程，在调节细胞的生存及死亡中具有重要作用。自噬相关基因过度上调可以导致自噬的异常激活，最终引起“自噬性细胞死亡”（也称Ⅱ型程序性细胞死亡）[11]。有研究报道，抑制肿瘤细胞HDAC的表达和活性时，细胞会发生自噬和凋亡现象[12]。实验发现人参皂苷Rh2能够上调自噬重要的基因LC3A，LC3B和beclin-1，证明人参皂苷Rh2在体内可以导致白血病细胞发生自噬可能通过抑制HDAC的活性和表达。HDAC6在白血病细胞K562高表达，并且和自噬凋亡关系密切[13]。抑制HDAC6能明显增加细胞的自噬和凋亡，抑制HDAC6可导致热休克蛋白（Hsp90）发生乙酰化，增加Hsp90乙酰化和降低Hsp90的表达都会引起细胞的自噬和凋亡[14]。人参皂苷Rh2在蛋白和基因水平上都能降低HDAC6和Hsp90的表达。HE和免疫组化的结果显示人参皂苷Rh2促进白血病细胞凋亡，其通路可能和下调HDAC6有关。综上可见，人参皂苷Rh2具有较好的体内抗肿瘤作用，其可能通过HDAC6，Hsp90 通路调节自噬凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖。因此，在以后研究中，将运用现代生物技术方法在体外去弄清人参皂苷Rh2通过HDAC6介导白血病细胞的自噬和凋亡途径的具体机制。
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[责任编辑 马超一]