钙蛋白酶系统对肌肉系水力的影响研究进展
摘 要：系水力是肉品质评价过程中重要的指标之一。大量的研究表明，系水力与宰后肌肉蛋白质的降解有关，而钙蛋白酶系统在此过程中起着重要的调控作用。本文结合国内外关于钙蛋白酶在肌肉系水力方面的研究，概述了系水力、钙蛋白酶系统，及其钙蛋白酶对系水力影响的可能作用机制，旨在为今后其在该领域的进一步研究提供参考。
关键词：钙蛋白酶；钙蛋白酶抑制蛋白；系水力；滴水损失；嫩度
Advance in Research on Calpain System Affecting Water Holding Capacity in Muscle
XU Chenchen， LUO Hailing
（State Key Laboratory of Animal Nutrition， College of Animal Science and Technology， China Agricultural University， Beijing 100193， China）
Abstract： Water holding capacity （WHC） is an important indicator of meat quality evaluation process. At present a large number of researches indicate that water holding capacity has relation with post-mortem muscle protein degradation， and the calpain system plays an important role in this process. Referring to domestic and overseas research about the calpain system and WHC in muscle， the review describes WHC as well as the calpain system and its possible mechanisms in influencing WHC to provide a reference for further research in this field.
Key words： calpain； calpastatin； water holding capacity； drip loss； tenderness
中图分类号：TS251.2 文献标志码：A
doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201506001
肌肉由75%水、19%蛋白质、3.5%的可溶性非蛋白以及2.5%的脂肪组成。其中19%的蛋白质为其骨架成分。肌肉内大部分水分存在于肌原纤维中及肌球蛋白粗纤丝和肌动蛋白/原肌球蛋白细纤丝之间的间隙中，此间隙可发生3倍体积的变化，因此肌原纤维间隙中的水分含量变化远大于蛋白质结合水分含量的变化。而肌肉的持水能力，也就是系水力又与蛋白质水解存在一定的关系[1]。Lawson[2]研究认为宰后僵直收缩过程中肌原纤维之间挤出的水分可能进入肌原纤维和细胞膜之间的通道中，该通道是由于钙蛋白酶的作用导致整合蛋白的降解。Mohrhauser等[3]研究认为，牛肉在成熟过程中μ-钙蛋白酶主要影响肌原纤维蛋白的降解。Wiklund等[4]研究得出，滴水损失与钙蛋白酶抑制蛋白活性呈显著负相关。随着肉品质研究的深入以及检测技术的创新，人们对钙蛋白酶系统与肌肉嫩度的关系已做了大量工作，本文就钙蛋白酶系统与系水力的关系及其机制进行阐述，探讨国内外相关研究，期望对肉品质的研究提供参考依据。
1 肌肉系水力概述
肉的系水力是非常重要的指标，不仅影响肉的外观，而且影响煮制过程中的汁液损失和咀嚼时肉的多汁性。利用核磁共振分析，肌肉中主要存在结合水和自由水。肌肉中水分主要存在两种形式：结合水和自由水。结合水在加工过程中非常重要，可加速脱水或冻后的复水干，但结合水受肌肉结构或电荷变化的影响很小。肌肉的滴水损失是模拟生鲜肉在自然吊挂以及贮存销售过程中水分的流失情况，能更准确地反映肌肉在生产加工过程中的失水情况。伴随滴水损失的产生实际是肌细胞内色素、肌红蛋白、营养成分等损失的产生，滴水损失不但直接影响肌肉的外观、嫩度和营养价值，还降低肌肉的经济价值[5]。
2 钙蛋白酶系统概述
钙蛋白酶属于一类复杂的Ca2+激活型蛋白酶家族。哺乳动物横纹肌中的钙蛋白酶类包括钙蛋白酶1、2、10和肌肉组织特异性同工酶钙蛋白酶3。Kapper等[6]研究表明，细胞骨架蛋白水解影响滴水损失，一般骨架蛋白的降解实际为水分的储存提供了更多的空间。
2.1 钙蛋白酶
钙蛋白酶（calpain，CAPN）被分离出的形式为钙依赖半胱氨酸蛋白酶，广泛分布在脊椎动物的细胞中。钙蛋白酶不能作用于肌动蛋白或肌球蛋白本身，也就是说只能作用于Z线。根据体外实验完全激活钙蛋白酶所需Ca2+浓度的不同，可将其分为钙蛋白酶Ⅰ（μ-calpain，CAPNⅠ）和钙蛋白酶Ⅱ（m-calpain，CAPNⅡ）（图1），前者激活所需Ca2+浓度为微摩尔级，后者激活所需Ca2+浓度为毫摩尔级。两者均有两个亚基构成：30 kD小亚基和80 kD大亚基。两种CAPN为同工酶，具有降解肌原纤维蛋白的作用。
肌原纤维降解时，μ-calpain激活时首先降解N2线的连接蛋白（Titin）和半肌动蛋白（Nebulin），导致维肌原纤维I带与Z盘之间的结合变弱或断裂，从而使肌纤维释放出的肌丝降解为小片段，释放出的肌丝小片段被细胞溶酶体捕获再进一步降解。Huff-Lonergan等[7]研究发现，钙蛋白酶系统引起肌原纤维收缩从而导致肌纤维蛋白的降解（如结蛋白）。Pomponio等[8]研究表明，在猪肉老化过程中，μ-calpain活性与肌原纤维蛋白的水解程度成正比。
2.2 钙蛋白酶抑制蛋白
钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin，CAST）是一种天然的具有高度特异性的内源抑制剂钙蛋白酶，非溶酶体的胞内蛋白酶，特异性的抑制μ-和m-钙蛋白酶，但是迄今为止没有发现它有其他蛋白质酶的水解活性。CAST是几乎完全无规则卷曲的构象，并且是非变性溶液的二聚体或四聚体，因为十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上的钙蛋白酶抑制蛋白制剂包含了比那些估计与大小排阻层析小得多的多肽。钙蛋白酶抑制蛋白的cDNA编码研究表明，钙蛋白酶抑制蛋白多肽包括4 个重复域，每个轻微同源的（23%～36%）结构域包括约140 个氨基酸，以及一个NH2-末端结构域，称为L域。这些钙蛋白酶抑制蛋白从68～78 kD不等，这取决于L域的大小。
钙蛋白酶抑制蛋白的螺旋结构能够阻止钙蛋白酶结合到膜上，然后钙蛋白酶降解肌间线蛋白，使α-肌动素和Z-盘的结合变弱或者断裂。且这种抑制作用并不受pH值的影响。Goll等[10]曾报道钙蛋白酶抑制蛋白在SDS-PAGE上的异常缓慢迁移是钙蛋白酶抑制蛋白多肽本身的属性（图2）。
3 钙蛋白酶系统对肌肉系水力的作用机制
3.1 钙蛋白酶的作用机制
很难将肉的成熟变化归结于某个蛋白酶及其抑制剂，有学者进行了模型研究。宰后刚开始，肉中Ca2+浓度很低，不足以激活CAPNⅠ；但是当pH值下降至6.1左右时，Ca2+浓度增加，足以激活CAPN I。在屠宰后12 h内，当温度从37 ℃下降到10 ℃，和成熟有关的各个参数迅速变化，并且在此期间，成熟期间的一半反应已经完成。随着宰杀后体内ATP逐渐耗尽，肌浆网失去了原有保留钙离子的能力，使肌浆中钙离子的浓度升高至10―6 mol/L以上，钙蛋白酶活性加强，进而被激活。活化后的钙蛋白酶对肌纤维和骨骼肌蛋白进行降解，降解后的蛋白质对于维持肌肉完整性和肉质嫩度有重要作用。
研究表明，钙蛋白酶对肌肉的作用机制主要表现在3 个方面：1）钙蛋白酶对连接蛋白和伴肌动蛋白的降解，使肌原纤维I带和Z盘结合变弱或断裂。2）对肌小节、结蛋白和细丝蛋白的降解。肌小节是肌纤维最基本的结构和功能单位，在肌膜附近的肌原纤维每一I带水平上都有分布，起着连接肌原纤维和肌膜的作用。肌原纤维间连蛋白有结蛋白和细丝蛋白，起着固定肌原纤维的作用，而它们的降解，则导致肌原纤维的有序结构被破坏，从而对肌肉嫩度产生促进作用。3）对肌钙蛋白（troponin）的降解。肌钙蛋白有钙结合亚基（TnC）、抑制亚基（TnI）和原肌球蛋白结合亚基（TnT）组成。肌钙蛋白T（相对分子质量30 000，由259 个氨基酸残基组成）与原肌球蛋白和肌钙蛋白C结合，只能被磷酸化酶b激酶磷酸化。但是，肌钙蛋白T的降解程度可以指示肌肉成熟过程的进度，但其他因素也必须考虑。
Kristensen等[11]认为宰后成熟过程中，纽蛋白和肌间线蛋白发生缓慢降解，而踝蛋白发生缓慢降解，使骨骼肌膜结构遭到破坏，使肌肉的系水力降低。Jalang’o等[12]研究发现肌肉流失的汁液中主要是肌浆蛋白质。Lametsch等[13]报道，通过电离质谱法鉴定猪肉背最长肌发现，肌肉蛋白的降解与一些结构蛋白（肌动蛋白、肌球蛋白、和肌钙蛋白-T）有关。Tait 等[14]通过遗传标记研究证明，CAPN1 和CAST对牛肉保水力有重要作用。
3.2 钙蛋白酶抑制蛋白的作用机制
钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）可抑制肌肉内蛋白质降解，是肌肉蛋白质降解的限速步骤。是通过抑制钙蛋白酶的活性而影响肉的嫩度，在大多数组织中其浓度足以抑制钙蛋白酶的活性。
钙蛋白酶抑制蛋白多肽编码和cDNA的表达说明每个结构域：第I、II、III和IV（图2），可以抑制的μ-或m-钙蛋白酶活性。第L域没有抑制活性。各个域的抑制能力不同：I域>IV域>III域>II域。大鼠的钙蛋白酶抑制蛋白（缺乏XL域和外显子3）抑制μ-钙蛋白酶比m-钙蛋白酶更有效，但这种差异是由去磷酸化产生的。不同物种间钙蛋白酶抑制蛋白结构域在其抑制μ-或m-钙蛋白酶能力会有显著的差异。另有研究表明，CAST在宰后肌肉中也会发生降解，并且降解后同样抑制钙蛋白酶的活性[15]。
CAST基因的表达与鸡肉肌纤维的生成有显著相关性[16]。Giusti等[17]研究发现印度内洛尔牛CAST基因的表达可以反映牛肉的品质和韧性。Casas等[18]曾报道，对牛肉CAST和CAPN1基因进行酶标记得出，CAST和CAPN1基因与牛肉嫩度有显著相关性。肌肉的系水力是反映肌肉嫩度的一个重要指标，因此可以把 CAST 基因作为影响肉质性状特别是肌肉系水力的候选基因。
4 影响钙蛋白酶活性离子因素
4.1 Ca2+
CaCl2是Ca2+主要添加来源，在肌肉中加入Ca2+能使钙蛋白酶最大限度的被激活，并且不同物种钙激活酶结构包括活性调节部位不同。Koohmaraie[19]于1989年最早提出向肌肉中加入Ca2+这种嫩化技术。注射10% CaCl2，6 min后可以显著改善牛肉颜色、滴水损失和蒸煮损失[20]。饲粮中缺乏NaCl时，添加大量CaCl2可以降低牛肉背最长肌的系水力和蛋白质溶解度[21]。用75 mmol/L CaCl2溶液进行腌渍时，牛肉嫩度提高，但是有苦味[22]。因此，可以认为Ca2+是通过激活钙蛋白酶系统来改善肌肉系水力。
4.2 焦磷酸钠（NaPPi）
焦磷酸盐具有较强的缓冲作用和持水能力， NaPPi 含有多个阴离子，显碱性，能缓冲肉中pH值降低趋势，提高肉成熟过程中pH值和离子强度，这些结果均可促进calpain的激活。焦磷酸盐（在1% NaCl条件下）的作用是解聚肌动球蛋白，分解为肌球蛋白和肌动蛋白，形成肌球蛋白单聚体，该作用与ATP有关。宰后的肉中注射NaPPi可加速钙蛋白酶的活化，改善肉品质[23]，而肌肉中注射NaCl 也和注射NaPPi一样，均可以提高肌肉嫩度，离子强度是改善嫩度的主要原因。
5 与钙蛋白酶有关的CaN-NFAT信号转导途径
CaN（钙调磷酸酶）是NF-AT的（活化的T细胞的核因子）转录因子的磷酸化调节免疫应答的基因，一旦钙调磷酸酶去磷酸化，NF-AT转录因子会转位到细胞核并直接激活免疫应答的基因，在Ca2+介导的信号转导中起重要作用[24]。高浓度的钙离子可以激活钙调神经磷酸酶和活化T细胞核因子，在细胞核内活化T细胞核因子依赖于钙离子来诱导免疫细胞的应答，但是细胞内的钙离子不足以完成此过程，因此，需要钙释放性钙通道维持持续的钙平台浓度。
该信号途径能够调节不同纤维类型的表达，同时钙蛋白酶抑制蛋白与不同纤维基因表达也有着密切的关系。因此，钙蛋白酶与CaN-NFAT信号通路的关系有待于进一步研究。英国诺丁汉大学通过对猪背最长肌CAST基因的表达推测得出，β-兴奋剂克伦特罗对钙蛋白酶抑制蛋白基因表达的调控与CaN-NFAT信号途径相关[25]。
6 结 语
肌肉的系水力与蛋白质的持水能力有关，因此在生产中可以试图增加某些饲料添加剂激活钙蛋白酶或降低钙蛋白酶抑制蛋白活性，以此来控制汁液的流失，提高肌肉的感官品质。钙蛋白酶系统对系水力的更具体的作用机制还有待于进一步研究。因此，利用分子生物学等技术手段进行深入研究钙蛋白酶系统与系水力之间的关系具有重要意义，为开发新型、安全、有效的肉质添加剂提供理论依据。
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