睾丸酮丛毛单胞菌3α—HSD的研究进展
摘 要： 3α-HSD（3α-hydroxysteroid dehydrogenase）是睾丸酮丛毛单胞菌在以类固醇为唯一碳源时，产生的一种类固醇脱氢酶，也是降解类固醇的关键酶。本文对睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD基因的调控、酶蛋白结构与功能等生物学特点进行阐述，总结了3α-HSD蛋白的两种获得途径：天然提取和人工诱导表达途径。从技术可行性、实用性和成本控制等几个方面，分析比对二者的优势和不足。介绍和展望了睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD在血清总胆汁酸测定、转基因生物工程、环境或食品中类固醇类激素检测及环境修复等领域的研究现状和应用前景。
关键词：睾丸酮丛毛单胞菌；3α-HSD；研究进展
中图分类号：Q939.9 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.06.014
睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）存在于人体胃、肠道、尿液及土壤、泥浆、水体中，是一种严格需氧、非发酵的革兰氏阴性细菌。睾丸酮丛毛单胞菌由Talalay 等[1]首先从池塘泥浆中分离得到，当其生长在含有类固醇的培养基上或环境中存在类固醇底物诱导时，可产生多种类固醇脱氢酶和11种降解酶，其中之一是3α羟基类固醇脱氢酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase， 3α-HSD），一种能够利用分解甾体类和多环芳烃类化合物作为菌体生长所需要的碳源和能源的关键酶。
目前认为，3α-HSD不仅是睾丸酮丛毛单胞菌在以类固醇为唯一碳源时，产生的一种醇脱氢酶，也是降解类固醇的关键酶，还广泛地存在于原核和真核生物体内，是人体调节性激素代谢水平的重要酶类[2-3]。1998年研究人员发现睾丸酮丛毛单胞菌的降解酶3α-类固醇脱氢酶在降解消化甾类物质中起主导作用，并对这个基因的调控机理进行了初步研究，认识到3α-HSD是C19～C27类固醇分解代谢途径中最初的酶之一[4]。在过去15年的时间里，睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD的结构和调控研究得到长足进展，其作用机制和功能的奥秘被逐步揭示，在几个关键领域的应用研究已取得显著成果。笔者拟就3α-HSD的研究进展结合自身研究项目进行简要综述，以期进一步系统了解睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD的表达调控机理，为今后拓宽其在环境修复、食品安全、医学检验研究领域的应用作以铺垫。
1 3α-HSD的生物学特点
1.1 3α-HSD基因的调控
3α-HSD基因全长774bp，编码258个氨基酸的肽链，肽链分子量在26.4KD左右。3α-HSD的表达过程较为复杂，在转录水平受多个因子调控，从最初的负调控因子阻遏蛋白RepA、RepB和活化因子Activator，到近年来发现的正调控因子TeiR基因和LysR基因，都对其转录过程起到抑制或促进作用。
1.1.1 阻遏蛋白（RepA和RepB） 在3α-HSD基因附近有4个开放的阅读框架（orf l、orf 2、orf 3、orf 4），与基因的诱导、表达与调控密切相关。3α-HSD基因受2个阻遏蛋白（RepA和RepB）的负调控，类固醇通过阻断阻遏蛋白与调控区的结合，诱导3α-HSD的表达[5]。Rep A和Rep B分别由420和78个氨基酸组成，由框架orf 2 和 orf 3编码。Rep B可与3α-HSD mRNA的5’端环状结构相结合，其编码框orf 3的方向与3α-HSD方向相反。RepA识别位点有两处，RepA与这2个序列结合，形成一个1.6 kb的环状结构，阻遏了细菌RNA聚合酶与hsd A启动子区域的结合，从而抑制3α-HSD基因的表达。国内外学者的研究表明，去除这2处DNA序列可显著提高3α-HSD基因的表达，而类固醇等甾体类诱导剂的加入可全面抑制阻遏蛋白RepB和3α-HSD基因mRNA的结合及RepA与顺式操纵子双位点的结合，从而促进3α-HSD基因的表达和翻译过程的顺利进行。
1.1.2 正调控因子 Activator是与增强子或与活化因子结合区域结合的蛋白，是一种在启动子上可以增加转录起始速度的DNA结合蛋白[6]。当活化因子与下游基因的启动子的活化因子结合部位结合后，就能促使更多的RNA聚合酶集聚到下游基因的启动子附近，提高下游基因的转录起始速度。研究表明，在C.testosteroni染色体上编码3α-HSD基因上游的2.6 kb处存在activator基因，该基因全长为564 bp。通过研究可以发现，利用睾丸酮丛毛单胞菌的activator 能提高3α-HSD/CR转录速率，通过将强启动子整合入C. testosteroni染色体中，使强启动子位于activator基因的上游来加强该细菌activator基因的表达，最终加强下游一系列基因表达的构想是可行的[7-9]。
类固醇诱导蛋白（testosterone-inducible regulator，teiR）基因和LysR基因是近年来被研究发现的3α-HSD基因正调控因子[10]。2004年，一种用于降解类固醇新的睾丸酮丛毛单胞菌蛋白被研究人员发现，中文译为睾丸酮诱导调节子[11]。TeiR序列在C末端保留了螺旋-转角-螺旋 （Helix-turn -helix， HTH） 式的LuxR基因DNA结合区域。与LuxR相似蛋白相同，该蛋白与目的基因转录起始点上游lux盒结合后可以激活或抑制目的基因的转录。国内外学者的多个研究同时表明[10-11]，在培养基中加入类固醇进行诱导的情况下，在基因表达过程中teiR基因紧密地控制着转录水平，而一个teiR缺失的突变菌株无法以类固醇作为单一的碳源。值得注意的是，在teiR缺失的突变体中3α-HSD基因也失去了降解类固醇的功能。这可能是由于突变体中，睾丸酮无法与teiR N端自主诱导物结合区域进行结合而不能进入细胞体内，从而抑制了睾丸酮与阻遏物结合诱导关键酶3α-HSD表达的能力，最终导致突变体丧失了正常的降解功能。利用反向对比实验可以发现当teiR基因插入到teiR缺失突变体菌株后，3α-HSD基因转录水平得以恢复。通过以上研究不难看出，teiR基因对睾丸酮丛毛单胞菌的酶解类固醇基因的转录过程进行正向调控，是3α-HSD等类固醇降解基因的mRNA完全表达的重要组成原件。大肠杆菌的共转化试验支持了这一观点，teiR基因与带有3α-HSD /CR基因的载体质粒后，结果发现在共转化的大肠杆菌中3α-HSD的表达明显高于单独转化的3α-HSD[11]。