灭幽汤对幽门螺杆菌相关性胃炎脾胃湿热证模型小鼠Toll样受体2、4的影响
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摘要：目的 探讨灭幽汤治疗幽门螺杆菌（Hp）相关性胃炎脾胃湿热证的作用机制。方法 将70只BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组、胃三联组和灭幽汤高、低剂量组（中药高、低剂量组），每组14只，采用复合因素建立BALB/c小鼠Hp相关性胃炎脾胃湿热证模型。成模后各给药组给予相应药物，连续14 d，采用免疫组化检测Toll样受体（TLR）2、TLR4蛋白表达，实时荧光定量PCR检测TLR2、TLR4基因表达，ELISA检测血清白细胞介素（IL）-6、IL-8的表达。结果 模型组TLR2、TLR4蛋白和基因表达水平及血清IL-6、IL-8含量均高于对照组（P<0.01）;中药高、低剂量组和胃三联组TLR2、TLR4蛋白和基因表达及血清IL-6、IL-8含量均低于模型组（P<0.01）;中药高剂量组TLR2、TLR4蛋白和基因表达水平及血清IL-6、IL-8含量虽低于胃三联组，但差异无统计学意义（P>0.05）。结论 灭幽汤可能通过抑制TLR2、TLR4及下游炎症因子的表达达到治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的目的。
关键词：灭幽汤;幽门螺杆菌相关性胃炎;脾胃湿热证;Toll样受体2;Toll样受体4;小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.02.018
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）02-0064-04
Effects of Mieyou Decoction on TLR2 and TLR4 in H. pylori-associated Gastritis Mice of Spleen-stomach Damp-heat Syndrome WANG Xiao-juan1， LUO Yan2， YU Bin1，XU Yin1， GUO Xuan2，DU Zhong-hua2， YIN Jiao2， XIA Rong2 （1.The First Hospital Affiliated to Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China;2.Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）
Abstract：Objective To investigate the mechanisms of Mieyou Decoction in the treatment of Hp- associated gastritis of spleen-stomach damp-heat syndrome. MethodsSeventy BALB/c mice were randomly divided into control group， model group， high concentration of Mieyou Decoction group， low concentrations of Mieyou Decoction group， and gastric triad group， with 14 rats in each group. BALB/c mice of Hp-associated gastritis of spleen-stomach damp-heat syndrome models were established by composite factor. After the success of modeling and continuous 14-day administration， the expressions of TLR2， TLR4 protein， TLR2 mRNA， and TLR4 mRNA were detected by immunohistochemistry and qPCR. ELISA was used to detect the expressions of IL-6 and IL-8 in the serum. Results Compared with control group， the expressions of TLR2， TLR4 protein， mRNA， IL-6， and IL-8 in model group significantly increased （P<0.01）;the expressions of TLR2， TLR4 protein， mRNA， IL-6， and IL-8 in high concentration of Mieyou Decoction group， low concentrations of Mieyou Decoction group， gastric triad group were lower than model group， with statistical significance （P<0.01）;the expressions of TLR2， TLR4 protein， mRNA， IL-6， and IL-8 in high concentration of Mieyou Decoction group were higher than gastric triad group， but the differences were not statistically significant （P>0.05）. ConclusionMieyou Decoction may play a role in the treatment of Hp-associated gastritis of spleen-stomach damp-heat syndrome through
intervention in the expressions of TLR2 and TLR4.
Key words：Mieyou Decoction;Hp-associated gastritis;spleen-stomach damp-heat syndrome;TLR2;TLR4mice
Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是天然免疫受体，在启动和调节天然免疫及诱导获得性免疫中起重要作用，是机体抵抗感染性疾病的第一道屏障[1]。TLR2、TLR4是目前TLRs系统中研究比较广泛的2个受体，有研究表明，TLR2、TLR4 与幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）致病密切相关，胃上皮细胞Hp是与宿主之间的第一接触点，而TLRs存在于这些细胞并通过识别病原相关分子模式启动机体内免疫系统，在Hp的致病作用中发挥重要作用[2-3]。本研究通过建立复合模型，观察用药前后TLR2、TLR4及下游炎症因子白细胞介素（IL）-6、IL-8的变化，探讨灭幽汤治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物、菌种与饲料
SPF级BALB/c小鼠70只，雌雄各半，8周龄，南京君科生物科技有限公司，许可证号：SCXK（苏）2011- 0003。Hp菌种：悉尼标准菌株（Sydney strain1，SSI），含有细胞毒素相关基因（cagA）蛋白和空泡细胞毒素（vacA），浓度为Hp菌液1×109 cfu/mL，湖南中医药大学提供。普通饲料和高脂饲料（普通饲料+8%蜂蜜+12%猪油）由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。
1.2 药物
灭幽汤由黄芩、蒲公英、三七、白及、青皮、陈皮、乌贼骨组成，药材均购于湖南省药材公司饮片加工厂。将上药浸泡、煎煮2次、取汁。2次药汁合并后浓缩至每毫升含原药材2 g，去除残渣，4 ℃保存。枸橼酸铋钾，丽珠医药集团股份有限公司，批号1212248;替硝唑，山东鲁抗医药集团，批号121004;克拉霉素，杭州中美华东制药有限公司，批号121101。
1.3 主要试剂与仪器
胶体金法幽门螺杆菌检测试剂盒，艾康生物技术（杭州）有限公司，批号201203139;TLR2、LR4抗体，武汉博士徳生物技术有限公司;二抗试剂盒均购自北京中衫金桥生物技术有限公司;反转录试剂盒， Fermentas;引物，上海生工生物工程有限公司;IL-6（E-25764）、IL-8（E-07253）ELISA检测试剂盒， R&D公司;荧光定量PCR仪、PCR板，Thermo。
2 实验方法
2.1 分组与造模
将70只雌雄各半BALB/c小鼠按体质量随机分为对照组、模型组、胃三联组和灭幽汤高、低剂量组（中药高、低剂量组），对照组予普通饲料饲养;模型组、胃三联组和中药高、低剂量组予高脂饲料饲养10 d后放入人工湿热箱（温度32 ℃±2 ℃，湿度95%±1%）内，继续高脂饲料喂养，自由饮水，于第16日以浓度为1×109 cfu/mL Hp混悬液0.3 mL/只灌胃。灌胃前24 h禁食不禁水，灌胃前4 h禁水，灌胃后4 h给食水。隔日接种1次，连续接种3次，感染后定植2周。2周后各组随机抽取2只小鼠做病理切片观察炎症情况，模型组、胃三联组和中药高、低剂量组各取2只小鼠以胶体金法检测血浆Hp抗体，电镜观察Hp定植情况。
2.2 给药与取材
按照小鼠与人体表面积比值换算公式计算小鼠给药剂量，胃三联组给药剂量为279.8 mg/kg，中药高剂量组给药剂量为12.4 g/kg， 中药低剂量组给药剂量为6.2 g/kg。对照组和模型组灌等量蒸馏水，每日1次。给药2周后断颈处死所有小鼠，将BALB/c小鼠仰卧位固定于鼠板，迅速取出胃标本，沿胃大弯剖开，用冰生理盐水冲洗干净，分别放入到盛有10%甲醛溶液、4%多聚甲醛、无菌DEPC水的容器中备用。
2.3 观察指标及方法
2.3.1 Toll样受体2、4蛋白表达检测 采用免疫组化方法。石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，pH 6.0枸橼酸钠缓冲液中微波炉加热修复抗原。3%H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗，5 min×3次。10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min。倾去血清，分别滴加浓度（1∶100）TLR2、TLR4的一抗，37 ℃孵育2 h。PBS冲洗，5 min×3次。分别滴加TLR2、TLR4二抗（1%BSA-PBS稀释），37 ℃孵育30 min。PBS冲洗，5 min×3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37 ℃孵育30 min。PBS冲洗，5 min×3次。加入DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，复染，封片。使用CMIAS真彩色病理图像分析系统对样本图像进行分析。每个样本随机选取3个高倍视野，计算黄褐色阳性表达面密度（阳性表达总面积/统计区域总面积）表示，以此为TLR2、TLR4蛋白的表达，进行半定量分析。
2.3.2 Toll样受体2、4基因表达检测 采用实时荧光定量PCR。提取胃黏膜组织总RNA。反转录cDNA总体系20 μL，以组织中mRNA为模板进行逆转录反应，反转录cDNA;反应条件：70 ℃加热5 min，37 ℃加热5 min，42 ℃加热1.5 h，72 ℃反应10 min。TLR2引物序列为正义5"-TTTGCTCCTGCGAACTCC-3"，反义5"-CAGTGCAGCCTGGTGACATT-3";TLR4引物序列为正义5"-CCTTTCAGGGAATTAAGCTCC-3"，反义5"-ACCGATGGA CGTGTAAACCA-3";PCR反应体系总体积30 μL，反应条件：95 ℃、10 min，95 ℃、5 s，54 ℃、30 s，共40个循环。反应结束后通过电脑自动分析和计算得到各样本的基因表达量。
2.3.3 白细胞介素-6、白细胞介素-8含量检测 严格按照ELISA检测试剂盒说明书操作，两指标检测操作方法及步骤相同。确定检测所需的酶标板孔数目，将标准品按每孔各100 μL依次加入孔中，并做好标记;将处理后的待测样本按每孔各100 μL依次加入，并做好标记;在标准品孔及待测的样本孔中分别加入50 μL酶联亲和物，充分混匀;将包被微孔板覆膜并在37 ℃孵育反应60 min后弃尽孔内液体，用预先稀释好的清洗液反复冲洗5次，并倒干孔内剩余液体;每孔依次分别加入底物Ⅰ、Ⅱ各50 μL，充分混匀。室温下避光反应15 min;然后每孔分别加入终止液 50 μL，充分混匀，终止反应;预留2个孔并做好标记，实验过程中该孔不加入任何样本，随标准孔和待测样本孔一同孵育反应后加入底物Ⅰ/Ⅱ反应，然后加入终止液终止该空白孔的实验，在酶标仪450 nm处读取该空白孔的OD值。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以x（—）±s表示，符合正态性和方差齐性的资料，采用完全随机化设计的方差分析、多重比较;不符合正态性和方差齐性，用秩和检验Kruskal-Wallis H检验，两组比较用Wilcoxon检验和Mann-Whitney U检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 造模情况
从小鼠饮食、饮水、大小便及精神状态结果分析，本实验造模方法成功使模型组小鼠表现出食少纳呆、少饮、大便溏、肢体困重等脾胃湿热证症状，与《中药新药临床研究指导原则（试行）》[4]中脾胃湿热证辨证标准相符。光镜下模型组小鼠胃黏膜多为充血肿胀，表面欠光整，腺体排列较紊乱，可见较多的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润，未见糜烂，模型组符合慢性非萎缩性胃炎表现。
4.2 胃组织病理观察
正常组小鼠胃黏膜上皮细胞排列整齐，细胞呈单柱状，固有层内有密集排列的腺体，个别小鼠胃黏膜底部可见少量散在的淋巴细胞。模型组小鼠胃窦部的炎症程度重，胃黏膜上皮排列紊乱，固有层内可见大量淋巴滤泡、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润，炎症细胞甚至到达黏膜下层。中药低剂量组炎症程度明显减轻，黏膜层少量炎性细胞浸润，固有层仅有水肿，少量淋巴细胞。中药高剂量组和胃三联组结果胃黏膜上皮细胞排列整齐，炎症几乎全部消失，见图1。
4.3 胃黏膜免疫组化染色结果
对照组小鼠胃黏膜组织TLR2、TLR4有极少量表达，模型组小鼠胃黏膜组织TLR2、TLR4有大量阳性表达，中药低剂量组小鼠胃黏膜组织较模型组明显减少，中药高剂量组和胃三联组小鼠胃黏膜组织有少量TLR2、TLR4阳性表达，见表1、图2、图3。
4.5 灭幽汤对小鼠血清白细胞介素-6、白细胞介素- 8含量的影响
与对照组比较，模型组IL-6、IL-8含量明显增加（P<0.01）;与模型组比较，、胃三联组小鼠IL-6、IL-8含量均明显降低（P<0.01）;中药高剂量组血清IL-6、IL-8含量虽低于胃三联组，但差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表3。
5 讨论
现代研究表明，Hp感染与脾胃湿热证密切相关：湿热环境利于Hp生长繁殖，在诸多证型中，脾胃湿热证更易导致体内环境改变，损伤胃黏膜屏障，给Hp入侵创造条件，脾胃湿热证的Hp感染率高，而Hp在致病过程中常表现出类似于湿热病邪隐匿性、渐进性、反复性、迁延性等特点[5]。本研究通过观察小鼠症状改变及病理特征、Hp测定，发现采用复合因素（肥甘食物+湿热环境+Hp）建立的实验模型有典型的Hp相关性胃炎及脾胃湿热证的症状及病理改变，表明本实验模型贴近临床，切实可行。
TLRs在微生物感染中是天然免疫反应的重要组成部分，它能特异性识别病原体，介导跨膜信号转号并诱导活化免疫细胞而触发一系列的炎症反应。有研究表明，TLRs主要表达在人胃上皮细胞上，在Hp感染过程中介导促炎细胞因子和趋化因子，引起慢性活动性胃炎，而TLR4基因多态性可以增加慢性胃炎患者胃黏膜感染HP的风险;Hp与TLR2表达呈正相关，且其下游的炎症因子IL-8、IL-10表达亦增加[8-9]。
灭幽汤不仅在临床上取得了较好疗效，同时本课题组前期也做了相关的实验研究[10-11]。本研究结果表明，模型组TLR2、TLR4及下游炎症因子IL-6、IL-8的表达显著高于对照组，经灭幽汤干预治疗后中药高剂量组、胃三联组其表达显著降低。因此我们推测Hp与湿热因素可能共同通过影响TLR2、TLR4及下游炎症因子IL-6、IL-8使胃黏膜组织产生炎症反应，而灭幽汤治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的机理可能是通过改变TLR2、TLR4及下游炎症因子IL-6、IL-8的表达，抑制及杀灭Hp并减轻湿热证候，从而降低胃黏膜组织的炎性程度以达到治疗目的。
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（收稿日期：2014-05-14;编辑：华强）