虎杖苷对NRK—52E细胞缺血再灌注损伤时TLR—4表达的抑制作用
材料
正常大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）（中国科学院上海细胞研究所）； DMEM和胎牛血清（美国Hyclone公司）；虎杖苷（上海科兴生物科技公司，纯度98%，批号201102）；RNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒购自（日本Takara公司）；realtime-PCR试剂盒购自（日本Takara公司）；PCR引物（由上海生工设计，日本Takara公司合成）；兔抗大鼠TLR4多克隆抗体购自（美国Sigma公司）；兔抗大鼠NF-κB多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；羊抗兔IgG-HRP（中国晶美生物公司）；TLR4阻断剂购自（美国eBioscience公司）；IL-1β，TNF-α ELISA试剂盒（美国Santa Cruz公司）。
2 方法
2.1 细胞培养及处理 NRK-52E置于含10%胎牛血清的DMEM中培养（37 ℃，5%CO2）。当细胞生长贴壁后，每隔2～3 d换培养液1次，待细胞30%融合时用0.25%胰酶（含0.02% EDTA）消化，1∶4传代。传代至5代的NRK-52E换用无血清培养液同步后进行虎杖苷干预：用含不同浓度虎杖苷（20，40 mg·L-1）的DMEM培养（37 ℃，5%CO2）30 min后进行体外缺氧复氧（I/R）模型实验；非虎杖苷干预组继续于含10%胎牛血清的DMEM中培养30 min（37 ℃，5%CO2）。实验分组：正常对照组、I/R模型组和虎杖苷干预组（20，40 mg·L-1 2个亚组），于缺氧复氧6 h/ 24 h收集上清液，同时收集细胞提取总蛋白和RNA。另外一组实验在细胞同步化后，预先30 min加入TLR4阻断剂（1 mg·L-1）或和虎杖苷（40 μg·L-1 ）后进行体外缺氧复氧实验。实验分组： I/R模型组、虎杖苷（40 mg·L-1）干预组、TLR4阻断剂干预组和TLR4阻断剂+虎杖苷（40 mg·L-1）干预组，于缺氧复氧6 h/24 h收集上清液，同时收集细胞提取总蛋白。
2.2 体外I/R模型制备 将细胞培养瓶置于37 ℃，含有混合低氧气体（1%O2，5%CO2，94%N2）的三气培养箱内。细胞于低氧条件下培养6 h，模拟缺氧后状态，然后再放置在37 ℃，5%CO2 ，饱和湿度的CO2孵箱，于24 h后终止实验，模拟再灌注过程。对照组则继续用10%胎牛血清的DMEM培养液培养于37 ℃，5%CO2 、饱和湿度的CO2孵箱内。
2.3 Realtime-PCR检测细胞TLR4 mRNA水平 按TRIzol试剂盒说明书操作提取总RNA，用紫外分光光度计进行浓度及纯度测定，-70 ℃保存。取总RNA 2 μg逆转录合成cDNA，具体按逆转录试剂盒说明操作，再取逆转录产物2 μL进行PCR循环。目的基因TLR4引物序列：上游5′-TGAAGCTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3′，下游5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3′，扩增片段为326 bp。内参GAPDH引物序列：上游5′-TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC-3′，下游5′-AAGATGGTGATGGGCTTCCCG-3′，扩增片段为156 bp。PCR反应条件：预变性94 ℃，30 s，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，熔解曲线 72～94 ℃，共35个循环。重复3次独立的PCR全过程。选择GAPDH作为内标，对目的基因进行均一化。目的基因相对表达量的计算采用2-ΔΔCt法，将再灌注后24 h对照组标本（Time 24 h）内目的基因表达水平设为1，对实验组标本（Time 24 h）内目的基因表达水平进行标准化。
ΔCt=Ct，Target-Ct，GAPDH
ΔΔCt=ΔCt，Time 24 h-Ct，Time 24 h
2.4 Western印迹检测TLR4和NF-κB蛋白水平 收集细胞，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂以裂解细胞。刮下细胞，置于Eppendorf管，并用破膜仪反复抽打细胞3次以剪切细胞内核酸，使蛋白充分溶出。静置于冰上20 min以沉淀蛋白，再以12 000 r·min-1， 4 ℃高速离15 min提取蛋白保存。蛋白定量按照试剂盒说明进行。蛋白上样量为20 μg， 12%SDS-PAGE电泳分离蛋白，采用半干式电转移法，将蛋白质转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶进行封闭，洗膜后按1∶200加入一抗，4 ℃孵育过夜。再次洗膜后加入HRP标记羊抗兔二抗，室温孵育1 h，洗膜后用ECL显色并曝光于X胶片，并用凝胶图像分析系统对胶片进行扫描分析和拍照。实验重复3次。
2.5 酶联免疫法（ELISA）检测IL-1β， TNF-α表达水平 提前20 min从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温，除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品（100 μL/孔）加入相应孔中，各孔均加复孔。混匀，用封板胶纸封住反应孔，37 ℃，孵育90 min。洗涤后加入酶结合物工作液（100 μL/孔）至上述反应孔。混匀后用封板胶纸封住反应孔，37 ℃，孵育90 min，洗涤后加100 μL显色剂至各孔，反应15～20 ℃后加100 μL终止液混匀，5 min内在450 nm处读吸光度。根据标准液浓度及光密度绘制出标准曲线，再根据标准曲线计算稀释后样品浓度，乘100倍为实际浓度。
2.6 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件包分析，计量材料以±s表示，统计分析采用单因素方差分析（ANOVA），多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法（LSD）。实验组之间比较采用q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 虎杖苷对I/R诱导NRK-52E细胞TLR4 mRNA表达的影响 I/R 刺激NRK-52E细胞24 h后，TLR4 mRNA表达显著强于对照组（P<0.05）；不同浓度的虎杖苷（20，40 mg·L-1）均能明显降低I/R诱导的NRK-52E细胞TLR4水平，呈浓度依赖性（P<0.05，图1）。
3.5 虎杖苷对I/R诱导NRK-52E细胞IL-1β，TNF-α蛋白表达的抑制作用与TLR4的关系 前面的实验结果显示，NRK-52E细胞缺氧复氧损伤时，虎杖苷可能通过TLR4/NF-κB致炎信号通路抑制下游炎性细胞因子IL-1β，TNF-α的蛋白表达水平。因此，本部分实验探讨虎杖苷是否通过干预TLR4进而抑制其下游NF-κB信号通路的激活。结果显示TLR4阻断剂及虎杖苷对I/R诱导的NRK-52E细胞NF-κB蛋白表达水平均有显著抑制作用（P<0.05，图5）；而同时加入TLR阻断剂和虎杖苷后，NRK-52E细胞NF-κB蛋白表达水平较单纯TLR4阻断剂干预组有所降低（P<0.05，图5）。TLR4阻断剂干预组及虎杖苷干预组均能明显下调I/R诱导NRK-52E细胞IL-1β，TNF-α的蛋白表达水平，同时加入TLR阻断剂和虎杖苷干预后，IL-1β，TNF-α蛋白表达水平较TLR4阻断剂干预组降低（P<0.05，图6），说明虎杖苷能增强TLR4阻断剂的抑制效应。以上结果表明，虎杖苷能与TLR4阻断剂协同抑制I/R诱导的NRK-52E细胞NF-κB信号通路的活化，结合虎杖苷也可直接阻断I/R诱导的NRK-52E细胞TLR4/NF-κB信号通路激活，提示其可能通过干预TLR4/NF-κB信号通路抑制I/R诱导NRK-52E细胞IL-1β，TNF-α蛋白表达水平。
4 讨论
急性肾缺血再灌注损伤和保护是一个十分复杂的过程，TLR4在肾缺血再灌注损伤中起了重要作用，并得已公认[7]。研究证实[8]，在AKI中肾小管上皮细胞TLR4表达增加，提示TLR4在AKI时，通 过识别外/内源性配体，激活促炎信号通路，调节感染部位免疫细胞的募集，启动天然免疫和炎症反应。NF-κB在许多炎症和免疫反应的调节中起重要作用，它控制了绝大多数免疫炎性基因的转录，是AKI发生过程中一个早期、关键的因素[9]。NF-κB亦是TLR4信号转导通路中重要的下游信号分子，激活后可诱导IL-1β，TNF-α等炎性因子和趋化因子分泌，促进炎症反应加剧[10]。本实验中，NRK-52E细胞缺氧6 h，复氧24 h后，细胞TLR4， NF-κB及炎性分子IL-1β，TNF-α表达明显增加，提示TLR4可能被I/R激活引起炎症反应，介导细胞的凋亡。
大量研究已证实虎杖苷对缺血再灌注损伤引起的组织器官损伤具有保护作用[11-13]。其作用机制可以概括为以下几个方面：①改善微循环；②抑制自由基产生； ③抑制白细胞作用； ④调节细胞内Ca2+浓度；⑤抑制细胞凋亡。但其是否通过抑制TLR4信号通路发挥对肾脏的保护作用，目前尚无相关研究报道。本研究结果表明，虎杖苷呈浓度依赖性下调I/R诱导的NRK-52E细胞TLR4 基因及蛋白表达，并下调NF-κB蛋白表达及其下游炎症因子TNF-α，IL-1β的表达水平。为深入阐明虎杖苷抑制I/R诱导NRK-52E细胞TNF-α，IL-1β的蛋白表达水平与TLR4信号通路的关系，本研究进一步研究发现，TLR4阻断剂对I/R诱导的NRK-52E细胞NF-κB及其下游炎症细胞因子TNF-α，IL-1β的蛋白表达有部分抑制作用，这可能与加入TLR4阻断剂的剂量较小有关，而虎杖苷能明显增强这一抑制作用，提示虎杖苷可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路发挥抗炎抗损伤作用，减轻细胞炎症反应，阻碍损伤进程。另外，本实验中虎杖苷对TLR4蛋白的抑制作用明显强于虎杖苷对TLR4 基因的抑制作用，其原因一方面可能是因为虎杖苷从翻译水平抑制了TLR4蛋白表达，另一方面可能是因为实验误差造成。综上所述，虎杖苷有望成为防治AKI的一个新靶点，而虎杖苷对于TLR4信号通路的影响有待进一步研究。
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