墨旱莲对香烟提取物杀伤NHBE细胞的保护作用及机制
［摘要］ 目的：研究墨旱莲提取物对香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）作用的正常肺细胞NHBE细胞的保护作用及其机制。方法：MTT法检测墨旱莲提取物对CSE诱导的NHBE细胞增殖的影响，DTNB比色法测定GSH含量，CDNB比色法检测GST活力，NADPH与2，6二氯靛酚钠（DCIP）测试NQO1活力，Western blot测定蛋白的表达。结果：墨旱莲提取物可以降低CSE对NHBE细胞增殖的抑制作用；恢复由CSE引起的细胞内GSH水平下降，降低诱导细胞中GST与NQO1活力及NQO1蛋白表达。结论：墨旱莲能够减少CSE对NHBE细胞的损伤，其机制可能与II相解毒酶相关。
［关键词］ 墨旱莲；CSE；GSH；GST；NQO1
墨旱莲（Ecliptae Herba）为菊科植物鳢肠的地上部分，性寒，味甘、酸，富含皂苷、豆甾醇等物质[7]。具有止血、清热解毒、保护肝脏和心血管作用，在临床上用于治疗肺结核咯血和痢疾。研究表明，墨旱莲可以通过降低NFκB的表达进而抑制HeLa细胞增殖[8]。本实验研究了香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）对人支气管上皮细胞NHBE（normal human bronchial epithelial cells）中的还原型谷胱甘肽（GSH）水平，GST与NQO1活力和相关蛋白表达的影响，以及墨旱莲提取物（Ecliptae Herba extract，EHE）对诱导模型的干预作用，探讨墨旱莲对CSE作用下的NHBE细胞保护作用和机制。
1 材料
1.1 细胞与试剂 人支气管上皮细胞 NHBE（ATCC）。胰蛋白酶、胎牛血清（美国Gibco公司）； 2，6二氯靛酚钠（DCIP， 日本TCI公司，批号MOBTE）；还原型辅酶Ⅱ（NADPH， 批号20101210）、牛血清白蛋白（BSA）（瑞士Roche公司）；二甲亚砜（DMSO）；四噻唑蓝（MTT），十二烷基硫酸钠（SDS），Tris，丙烯酰胺，过硫酸铵（APS），四甲基乙二胺（TEMED），苯甲基磺酰氟（PMSF），甘氨酸（美国Sigma公司）；RPMI 1640 培养基（批号20110127）、谷胱甘肽S转移酶测试盒（批号20110426）、谷胱甘肽测试盒（批号20110504） （南京建成生物工程研究所）；RIPA细胞裂解液（编号P0013C， 碧云天生物技术研究所）；抗NQO1抗体（批号D2711， 美国Santa Cruz公司）。
1.2 仪器 Class Ⅱ Biosafety Cabinet生物安全柜（美国Labconco公司）；Nikon Eclipse TS100倒置显微镜（日本尼康公司）；酶标仪（美国BIORAD公司）； ZWA型微量振荡器（常州国华电器有限公司）；HH60型数显恒温搅拌循环水浴锅（常州国华电器有限公司）；AL204天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；LDZX50K型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；5430R冷冻离心机（德国艾本德公司）；Nanodrop 1000微量紫外分光光度计；HERA CELL 500型CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；电泳仪（美国BIORAD公司）。
1.3 墨旱莲提取物的制备 墨旱莲药材购于安徽井泉药业有限公司，批号20110701，经南京中医药大学药学院吴德康教授鉴定。取墨旱莲200 g，用10倍量的80%乙醇回流提取2次，每次2 h，旋转蒸发得到墨旱莲提取物，试验时提取物用80％乙醇溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，每组均加入不同乙醇使有机相浓度一致。
1.4 CSE的制备 在实验前30 min内参照Yunchao Su等的方法制备CSE[9]。取某品牌香烟1根，去掉过滤嘴，燃烧形成的烟雾溶于10 mL无血清培养基中，制成100%的CSE溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后给药。
2 方法
2.1 细胞生存率测定 NHBE细胞用含10%灭活胎牛血清的1640培养基，于37 ℃，5%CO2 条件下培养，隔天换液，4 d传代。取生长状态良好的NHBE细胞，调整细胞为5×104 个/mL。取96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液100 μL，培养24 h后，加入10%CSE和墨旱莲提取物，使生药终浓度为0，7.8，15.7，31.3，62.5，125，250，500，1 000 μg·L-1，阴性对照组加入10 μL无血清培养基。继续培养24 h后，去除原培养基，用100 μL PBS清洗后加入100 μL无血清培养基，各组加入5%MTT，4 h后，去除培养基，每孔加入100 μL DMSO溶液，震荡10 min，置于酶标仪上于490，570 nm波长处检测吸光度A。
细胞生长抑制率=[（A570-A490）空白-（A570-A490）给药组]/（A570-A490）空白×100%
2.2 细胞培养及蛋白提取 取生长状态良好的细胞，用冰磷酸盐缓冲液洗2遍后，加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下13 000 r·min-1离心5 min，收集上清，用微量分光光度计测定蛋白浓度。细胞裂解液在实验前加入PMSF使其浓度为1 mmol·L-1。
2.3 墨旱莲提取物对细胞GSH水平与GST活力的影响 取各组细胞裂解液，按照试剂盒说明书进行测定。在酶标仪下测定各组吸光度，计算得出细胞内GSH水平与GST活力。
2.4 墨旱莲提取物对NHBE细胞NQO1活力的影响 NQO1的活性是以2，6二氯靛酚（DCIP）的第2电子受体进行测定[10]。取定量好的蛋白5 μ加入0.9 mL反应缓冲液[含50 mmol·L-1 TrisHCl（pH 7.5），0.25 mmol·L-1 NADPH，80 μmol·L-1 DCIP]，在 600 nm测定 3 min，以每毫克样品蛋白每分钟吸光度的下降值表示NQO1的活力。
NQO1活力=（A开始-A结束）/反应时间（3 min）/蛋白浓度
2.5 Western blot检测细胞中NQO1蛋白表达 细胞裂解液煮沸变性后进行SDSPAGE凝胶电泳，灌制5%浓缩胶，13%分离胶，上样量30 μL，恒压80 V 20 min，之后把电压提高到100 V，继续电泳90 min，然后恒流200 mA，120 min湿转，将蛋白从SDSPAGE凝胶转至PVDF膜上，BSA封闭后加入抗NQO1抗体（1∶200）孵育过夜，最后加入二抗孵育2 h，ECL显色。
2.6 统计学分析 数据用±s表示，采用SPSS 16.0统计软件经行方差分析，组间比较采用t检验，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。
3 结果
3.1 墨旱莲提取物对NHBE细胞增殖的保护作用 CSE对NHBE有损伤作用，10%CSE作用24 h对细胞的抑制率为30.21%。在较低浓度下，墨旱莲可以有效降低CSE对NHBE的毒害作用，且有着量效关系，其中在125 μg·L-1下细胞的抑制率为18.39%。在较高的浓度下，墨旱莲具有一定的细胞毒作用，故后续试验药物浓度不超过250 μg·L-1，见图1。
3.2 墨旱莲提取物NHBE细胞内GSH含量的影响 CSE可以显著降低NHBE细胞内的GSH水平（P＜0.05），用10%CSE处理NHBE细胞24 h，细胞内GSH水平下降至空白组的31.54%；而同时给予墨旱莲提取物可以减少细胞内GSH含量的降低，在15.7，31.3，62.5，125，250 μg·L-1质量浓度下，GSH含量分别为空白对照组的39.86%，46.39%，57.21%，72.38%，75.50%，见图2。
3.3 II相解毒酶活力测定 CSE可以极显著提高NHBE细胞内GST与NQO1的活力（P＜0.01），用10%CSE作用 NHBE细胞24 h，细胞内GST活力提高为空白组的1.78倍；NQO1活力提高为空白组的2.14倍。而墨旱莲提取物同时给药组的GST与NQO1活力会显著降低（P＜0.05），且呈量效关系，见图3，4。
3.3 NQO1蛋白表达的测定 Western blot结果显示，10%CSE作用24 h可以明显提高NHBE细胞中NQO1的蛋白表达，而同时给予半枝莲提取物可以
4 讨论
由于环境日益恶化，人们接触到多环芳香烃类、黄曲霉素、烟草和烟气、亚硝胺类的机会越来越多。其中吸烟是肺癌的最大诱因，80%～90%的肺癌是由吸烟引起，30%由癌症引致的死亡是出于吸烟。而被动吸烟也会明显地增加非吸烟者患上肺癌等疾病的机会。CSE含有超过4 000种化学成分，其中包括多种有毒成分，可通过不同的途径作用于上皮细胞、平滑肌细胞和免疫细胞，影响呼吸系统的功能，这些致癌物进入人体后首先经过I相代谢酶（如CYP450）的作用，形成亲电子的活性中间体，它们会攻击细胞中的大分子，比如DNA和蛋白质，导致癌症的发生。而体内的II相代谢可以使亲电子的致癌物或其中间体解毒及去除，其主要作用机制是通过将这些亲电子化学物质硫酸化、糖脂化、谷胱甘肽化或中和。而这些反应都是由II相解毒酶介导的，故有毒有害物质可以激活细胞内的自我防护机制，提高II相解毒酶的表达及活力。GST其主要作用是催化还原型谷胱甘肽（GSH）与亲电子物质结合，继而排出体外；与胆红素、甾醇等亲脂性物质相结合，抑制脂质过氧化作用；NQO1将体内的醌类等异源性物质还原为氢醌，继而被结合排泄，避免醌类物质转化为半醌类，从而达到保护细胞的作用；GSH是体内重要的抗氧化剂，可清除自由基等氧化剂。
在本实验中，CSE可以引起NHBE细胞的氧化应激，细胞启动自我防护机制，具体表现为提高NQO1蛋白的表达，继而诱导II相解毒酶NQO1活力及表达的升高，GST活力也有提高，消耗GSH使其含量降低，但是仍有部分NHBE细胞的损伤及死亡。而加入墨旱莲提取物后，细胞内各项指标均有恢复到正常水平的趋势，说明墨旱莲具有抗氧化的功效，可以保护CSE对NHBE细胞的损伤，其作用机制可能为减少CSE的氧化应激。
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