力学因素在体外构建组织工程化软骨中的应用
田甜 综述，章庆国 审校
[摘要]力学因素是软骨组织工程中的重要影响因素之一。近年来的研究表明，力学作用可以刺激细胞外基质的分泌，改变三维支架上培养的软骨细胞的新陈代谢，从而促进软骨组织的生长与重建。本文就力学因素对软骨细胞增殖分泌的促进、力学刺激的传导机制及生物反应器在软骨组织工程中的应用等方面做一综述。
[关键词]力学载荷；软骨细胞；力学信号；生物反应器；软骨组织工程
[中图分类号]Q813 R318.01 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）03-0405-03
Application of mechanical loading in vitro with constructing tissue-engineered cartilage
TIAN Tian1,ZHANG Qing-guo2
(1.Department of Plastic Surgery, Affiliated Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009,Jiangsu,China; 2.Auricular Reconstructive Center of Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100144, China)
Abstract: Mechanical factor is one of the most important factors in cartilage tissue engineering. Recently,this research study have been revealed that mechanical loading can stimulate the release of extracellular matrix, changes the neo-metabolic activity of cultured chondrocytes in 3D scaffolds, and subsequently accelerate the growth and remodeling of cartilage tissue. The aim of review is to discuss the promotion of proliferation and secretion of chondrocytes by mechanical factor, mechanisms by which chondrocytes respond to mechanical signals, and the applications of bioreactor in cartilage tissue engineering.
Key words: mechanical loading; chondrocyte; mechanical signal; bioreactor; cartilage tissue engineering
多种原因造成的关节软骨病变比较常见，软骨损伤后缺乏自愈能力，寻找软骨缺损修复的方法一直是临床的难题。近年来，随着组织工程学技术的发展，开展体外构建组织工程化软骨的研究越来越被人们重视。适当的力学刺激因素可以在一定程度上克服传统软骨细胞培养条件的不足，满足细胞在可吸收聚合物中的营养需要，减少处于中心部位的软骨细胞由于营养不良或代谢不畅而导致的生长迟滞甚至死亡。因此，对软骨细胞进行三维立体培养时，研究力学刺激对细胞的影响、力学信号的传导机制以及应用生物反应器对体外培养的细胞大规模扩增都将对软骨组织工程的发展有着非常重要的意义。
1软骨组织的生物力学性状
软骨由软骨细胞和软骨基质构成，软骨细胞包埋于软骨陷窝内，软骨基质由软骨细胞产生和分泌。软骨基质主要由胶原和蛋白多糖组成。胶原纤维在软骨的不同层面排列形成不同结构，具有很强的拉伸性能；蛋白多糖凝胶分散在胶原纤维网之间，本身不具有抗压作用，但由于蛋白多糖有很强的吸水膨胀性，加上蛋白多糖上经常有固定负电荷互相排斥，使它有充分扩展倾向，而这个倾向却被周围的胶原纤维网约束了，最终两者达到压力平衡[1]，使软骨内部在未受外力时就存在一个膨胀压（渗透压）。当外力大于膨胀压时，引起液体外流，蛋白多糖浓度增加，渗透压增大以对抗外压力，同时将压力传递给胶原纤维，使压应力转化为张应力。因此，外界因素如异常应力导致蛋白多糖、胶原的减少、破坏或微细结构的改变等，都会引起关节软骨力学性能的变化。
2力学刺激的应用
2.1 压力：压力是正常人体关节软骨最主要的受力，可以将其看成是由一系列随时间变化的动态成分和随时间缓慢发展的静态成分组成[2]，因而体外研究实验多采用的压力方式有两种：一种是持续静压力，另一种为动态压力。
静压力多为早期研究所关注的加载方式，它的施加使组织保持持续恒定的压缩状态，但普遍发现基质的合成将受到抑制。近年的研究对于静压力的作用效果有更深一步理解，Quinn 等[3]认为静压力使培养基内可溶物质运输受限，而导致软骨细胞代谢水平下降，Ragan 等[4]发现40h持续静压力只是促使新合成的蛋白多糖分子流失到培养基中，并不伴随蛋白多糖分子的大小、成分的改变，认为静压力不引起细胞代谢途径的变化。
研究发现，在循环动态压力作用下，软骨组织内四种物理特性发生变化：静水压、毛细液流及其引起的离子浓度与电荷变化、流能和组织与细胞变形。Huang 等[5]分组对骨髓间充质干细胞施加周期性压力(强度为压缩10%、频率为1 Hz，4 h/d)，处理3、7、14天后, 发现TGF-β1 干预组、压应力干预组、TGF-β1与压应力复合干预组的TGF-β1 及软骨分化标志物的表达, 均较静止对照组增强，提示压应力可能促进骨髓间充质干细胞的软骨性分化，并推断其通过增强TGF-β1基因表达来调节。一些生长因子也与力学刺激具有某种联系，如生理范围内的正弦动态压力刺激可使胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对关节软骨蛋白及蛋白多糖合成的促进作用的时间提前，提示力学作用不但可以单独刺激关节软骨细胞，还可促进IGF这种可溶性细胞生长因子与相对分散的单个细胞的结合[6]。这也提示联合应用力学因素和生物活性因子优于应用单一方法，可以更有效地进行体外软骨组织构建和体内缺损的修复。
2.2 流体静压力：流体静压力，也有称其为生理液态压力，是生理活动时对软骨细胞影响最大的力[7]。实验表明选用的间歇性流体静压力负荷低于或近似于生理水平(1～10MPa)，将不会引起细胞形变[8]，并能提高软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ胶原的mRNA 的表达水平[9]，对基质的合成、积累有重要作用；而超过生理范围的持续高流体静压力则会改变细胞骨架结构、破坏高尔基体，导致正常的软骨细胞向关节炎样细胞变化[10]。
2.3 剪切力：流体剪切力是机体内微环境重要组成部分。目前，流体剪切应力模型有锥板流动室、平行平板流动室、板板流动室、圆柱管流动室和径向流动室。李洪鹏等[11]利用平行平板流动室对人骨髓间充质干细胞加载0.5Pa 的流体剪切力30min后，发现细胞增殖能力提高，细胞活性增强，S期细胞百分比较对照组增高约180%。Malaviya等[12]将3.5Pa的流体剪切力作用到单层培养的牛原代关节软骨细胞上，96h后发现流体剪切力可明显促进软骨细胞的增殖，施加剪切力组培养液中的TGF-β1是静止组的3.5倍，培养液起到了有丝分裂原的作用；当用抗TGF-β1抗体或抗TGF-β1II型受体抗体时，这种作用被阻断，但由于阻断作用是部分的，可以推测流体剪切力促进软骨细胞的增殖是部分TGF-β1及其受体介导的。Waldman等[13]选用小幅度的剪切力（1%～3%应变），先将软骨细胞种植在生物陶瓷支架中，让其自由生长4 周后，再施加间歇性剪切力作用4周，结果发现8 周后的样本对比未加力组，无论从厚度、脱水重量、压缩模量、平衡模量还是蛋白多糖、胶原量都显著增加，这可能与剪切力作用改变了细胞外基质超微结构有关，有待进一步研究。
2.4 离心力：离心力的施加主要是利用复合物在离心机内高速旋转，从而对复合物产生离心力，该办法不要求特殊设备，较为简单。将高密度软骨细胞接种在离心管内，离心力可能发挥了类似生物体内应力的作用，可以使软骨细胞按固定方向进行空间排列，在支架材料中形成一定的初期分布，有利于营养物质的交换和细胞的增殖代谢。孔清泉等[14]将软骨细胞种植在脱细胞软骨基质材料上，并移入离心管中培养，每天取出离心管置于离心机上离心3次，每次离心时间20min，相对离心力约为200g，复合物培养至8 周后与静态培养组比较发现，离心力的作用主要是能刺激软骨细胞分泌GAG和Ⅱ型胶原增加，并使该类软骨组织具一定层次排列结构，而静态培养的类软骨组织排列较为紊乱。刘天一等[15]研究离心力和摇床力对三维支架软骨诱导剂培养的猪骨髓间充质干细胞向软骨分化的影响，发现第4 周和8 周时，两组实验组的细胞材料复合物形状保持良好，细胞生长情况、软骨陷窝形成、蛋白多糖沉积及Ⅱ型胶原合成均明显优于对照静止组，从而表明种子细胞体外构建组织工程化软骨中, 施加力学刺激也可以促进软骨组织成熟。
2.5 张力：在生物体运动过程中, 细胞组织常常受到动态的牵拉应力作用, 体内牵拉力是通过细胞外基质传递到细胞的，因此张应力学模型通常是以弹性膜为基底材料，利用模板、液体或气体对基底膜施加可控的位移或压力作用, 引起培养膜发生弹性变形, 从而使粘附于膜上的细胞受到相应的张应变作用。Wright等[16]对体外培养的人长骨关节软骨细胞施以牵张力后发现，细胞cAMP及蛋白多糖的合成增加。低频率、低强度的牵张力可促进软骨细胞合成分泌蛋白多糖，而高频率、高强度的牵张力则抑制蛋白多糖的合成和分泌[17]。所以适当的张力可促进单层培养软骨细胞的增生和分泌，这与体内研究的结果一致。
3力学载荷可能的信号传导机制
力学刺激体外细胞所引起一系列的变化，是通过一定的途径, 将细胞外力学信号传导至细胞内，从而启动或调节相关的基因蛋白表达分布。国内外大量研究表明，机械载荷刺激细胞组织后，其基本的机械力学信号转导机制与调节过程具有相同信号途径，主要为3 条：通过细胞外基质信号-跨膜整合素-细胞骨架构像改变对信号的传递，激活细胞膜力敏感离子通道介导细胞内钙离子水平升高，触动G蛋白偶联酪氨酸激酶磷酸化与促分裂原活化蛋白激酶调节的级联反应, 各信号分子之间存在网络状调控, 最后导致转录因子的激活。戚孟春等[18]用过高的牵拉应力(4 000με,0.5Hz)系统干预骨髓间充质干细胞后，激光共聚焦显微镜观察到细胞骨架F-actin解聚和重排, 并诱发部分细胞发生凋亡，表明细胞骨架是骨髓间充质干细胞传导力学信号通路中重要的一环。整合素对于许多类型的细胞粘着于细胞外基质蛋白具有重要作用，是介导力学的重要物质，因为它们能够与肌动蛋白结合的蛋白质相互作用，通过细胞骨架来与细胞外基质产生联系。Holmvall等[19]在软骨细胞中及软骨肉瘤细胞中均可分离到α1β1和α2β1整合素，能够表现与软骨特异性基质成分II型胶原的高亲和性；在力学刺激下，基质成分II型胶原及整合素mRNA均明显升高，而β1整合素亚单位并未改变，α5或α2整合素有所升高，α2β1整合素与II型胶原结合位点很可能介导了力学刺激。
4生物反应器的应用
目前体外软骨构建技术主要存在组织“空心”、力学强度差以及难以精确塑形等问题。生物反应器的出现及其在软骨组织工程中的应用为解决这些问题带来了希望[20]，主要是因为它能模拟体内微环境，为细胞生长传输物质，并可施加各种力学刺激，弥补体外培养条件的不足。因此，生物反应器已逐渐成为软骨组织工程的一个重要研究领域。
4.1 机械搅拌式生物反应器：该生物反应器的支架-细胞复合物悬在反应器的瓶塞上，支架周围加入培养液，位于培养瓶底部的磁棒不断搅拌，每隔数日更换培养液以保持营养。这种生物反应器的剪力梯度与营养酸碱度变化曲线及不均匀的物体交换率可影响细胞生长。然而，这样的培养体系能使CO2和O2的浓度达到一个类似正常的平衡状态，避免静态培养中O2的降低和CO2的聚集[21]。
4.2 灌注式生物反应器：该生物反应器用继发性液流替代机械性搅拌，通过蠕动移液泵使培养液循环流动。其中的细胞处于一个动态层流场且时刻保持恒定营养供应的环境，同时还避免了常规一次性全部换液带来的培养环境的骤变[22]。与振荡式生物反应器相比，它所培养的细胞密度可提高20倍。目前，这一装置多用于三维材料-细胞复合体的培养。
4.3 间歇性生理液压生物反应器：该生物反应器是先将软骨细胞或软骨块置于培养皿中，其中加满完全培养液，将培养皿上盖双层压力膜，排出培养皿内空气，使压力膜与培养皿贴紧至不留气泡。将该培养皿置于圆柱形压力室中，压力和频率由计算机控制下的压力阀来调控。Carver等[23]发现间歇性生理液态压力可明显促进聚羟基乙酸网上培养的马软骨细胞细胞外基质的合成与分泌，其蛋白多糖的含量至少是无压力培养下的两倍。
4.4 旋转式微重力生物反应器：该生物反应器由两个同轴的容器构成，内瓶静止，允许气体通过瓶壁与外瓶交换；外瓶瓶壁封闭，两瓶中间为培养液。通过调节外瓶转速，使离心力和重力平衡，达到模拟体内细胞所处的微重力状态。该系统使细胞在支架材料内分布较均匀、分化状态较好且细胞密度较大[24]。在软骨细胞体外扩增的初期，由于软骨细胞和支架材料尚未复合紧密，力学作用会使复合不牢的软骨细胞脱落而无法达到软骨细胞-支架材料共同培养，体外扩增的目的。而该装置破坏性应力相对较小或无明显破坏性应力，可以克服上述问题，并产生大的软骨，且组织结构及成分都接近正常软骨，可以用于修复关节软骨的缺损。
5小结
模拟正常体内的力学环境对于体外构建组织工程化软骨起到非常重要的作用。利用动态压力、流体静压力、剪切力、离心力、张力都能提供不错的力学刺激，尤其是生物反应器的设计与应用更加优化了培养环境，提高了工程化软骨的质量。虽然力学因素的作用机制还不十分明确，构建的组织工程化软骨的生物力学性能仍低于正常体内软骨的力学性质, 但随着研究的深入和科学技术的发展, 用组织工程技术来修复软骨缺损及病变的时代已不再遥远。
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[收稿日期]2008-12-27[修回日期]2009-02-11
编辑/张惠娟