吉富罗非鱼核DNA含量的测定
摘要：以吉富罗非鱼的外周血细胞为样本、小鼠淋巴细胞DNA为标准（7.0 pg/2C），采用流式细胞术结合内标法测定血细胞的核DNA含量。结果显示：吉富罗非鱼的核DNA含量为小鼠淋巴细胞的0.339 2±0.009 0倍，绝对含量为（2.374 5±0.063 0） pg/2C。
关键词：吉富罗非鱼；流式细胞术；DNA含量
中图分类号： S917.4 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0036-03
罗非鱼（Tilapia），俗称非洲鲫鱼，以其生长快、食性杂和适应性强等优势成为国际上养殖最广泛的品种之一，是国际贸易第三大水产品。中国的罗非鱼产量占全球总产量的一半，其出口量高居世界第一位[1]。吉富品系尼罗罗非鱼（genetically improved farmed Tilapia Oreochromis niloticus，GIFT，简称吉富罗非鱼）是中国主要养殖的罗非鱼品种（系）之一，也是中国养殖的罗非鱼品种中生长最快的品种（系）之一。吉富罗非鱼是由国际水生生物资源管理中心、挪威水产养殖研究所和菲律宾的一些国家级研究机构通过对4个非洲原产地（埃及、加纳、肯尼亚、塞内加尔）直接引进的尼罗罗非鱼品系和4个在亚洲地区（以色列、新加坡、泰国、中国台湾）广泛养殖的尼罗罗非鱼品系进行混合选育进而获得的优良品系[2]。经过近20年的种内群体间杂交和选育，该品系已经显示出优越的生长优势和潜能[3-4]，引起了亚太地区的广泛兴趣和关注，多个国家进行了引种并启动了对其进一步改良和推广的国家育种计划[5]。为了促进中国罗非鱼养殖持续稳定的发展，2006年8月世界渔业中心向中国水产科学研究院淡水渔业研究中心输送了60个家系的吉富罗非鱼，以期在中国进行吉富罗非鱼的选育和推广工作，这是中国第一次引进如此多家系的吉富罗非鱼。目前研究人员已经对该群体进行了连续3代的家系选育，同时开展了对不同家系的生长性能[6-7]、遗传多样性[8-9]等方面的评估工作。
脱氧核糖核酸（DNA）是绝大多数生物体内的遗传物质，一个细胞核中所含的DNA总量对于某物种是一定的。生物DNA含量的研究不但是研究物种间差别的重要方法，而且对分类和系统演化的探讨、物种进化研究等具有参考意义，同时也是种质资源和种质质量的主要指标之一。本试验对我国新引进的吉富罗非鱼群体中的DNA含量进行测定，以期为吉富罗非鱼的人工选育和种质资源评价等提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物 试验用吉富罗非鱼取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，为同一批繁殖的苗种。将所有的鱼在重量为20 g左右时进行PIT（passive tntegrated transponder）标记，然后在同一池塘内养殖300 d，再测定每尾鱼的体质量、体长、体高、体厚等，并计算300 d的增重。从试验用罗非鱼中随机抽取其3个家系（A、B、C），A家系13尾，B、C家系各15尾，共43尾，分别记为A1～A13、B1～B15、C1～C15；其中雌鱼20尾，雄鱼23尾。试验用昆明种小白鼠由卫生部核医学重点实验室江苏省原子医学研究所惠赠。
1.1.2 仪器与试剂 FACSCalibur流式细胞仪，BD公司。碘化丙啶（propidiamiodide，PI）购自 Sigma 公司；RNase购自 Sigma 公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 单细胞悬液的制备及固定 取4周龄的昆明种小白鼠，断颈处死后剖腹，剪开胸骨，可见心脏上方灰白色柔软的组织块，即胸腺。分离周围组织，取下胸腺并用PBS清洗。轻压组织块得浑浊的液体，用200 μm细胞筛过滤，即得单细胞悬液。1 000 r/min离心15 min后弃上清，加PBS缓冲液重悬沉淀物并计数。调整细胞浓度，使加入的预冷100%乙醇变为70%浓度时，淋巴细胞浓度调整为106个/mL。-20 ℃ 固定过夜或者冷藏待用。
从试验鱼尾静脉取约0.5 mL血（用ACD抗凝剂湿润注射器，以防凝固），严防溶血。4 ℃静置过夜后用PBS缓冲液将鱼血稀释，清洗1次后重悬于PBS溶液中并用血细胞计数板计数。加入预冷的70%乙醇-PBS混合液，并调整细胞浓度至106个/mL，-20 ℃固定过夜或者冷藏待用。
1.2.2 PI染色 分别取0.5 mL小鼠淋巴细胞固定液和鱼血固定液，混合、离心去除固定液后用PBS缓冲液清洗1次，重悬于1 mL的PI-PBS（PI浓度为50 μg/mL）染色液中，加入2 μL 100 mg/μL RNase，避光孵育 0.5 h后过200 μm细胞筛，上机检测。
1.2.3 样品检测 采用 FACSCalibur 流式细胞仪测定各样品的荧光密度值（PI fluorescence），流速控制在低速（12 μL/min），每次检测10 000个细胞。由流式细胞仪自带的数据处理软件CELLQuest Pro自动计算每次检测样品的平均荧光密度值。
1.2.4 数据处理 每次检测样品的细胞核DNA含量依照以下公式计算：P1=E2/E1×P2。式中：P1表示鱼血细胞的DNA含量，pg；P2表示对照小鼠细胞的DNA含量，pg；E1表示鱼血细胞的平均荧光密度值；E2表示鸡血细胞的平均荧光密度值。小鼠淋巴细胞的DNA绝对含量以7.0 pg/2C为标准[10]。用流式细胞仪自带的数据处理软件ModFit软件分析细胞周期。所有试验数据均用 SPSS 10.0进行统计分析，结果表示为“平均值±标准差”。
2 结果与分析
2.1 吉富罗非鱼的细胞周期
吉富罗非鱼细胞与小鼠淋巴细胞的荧光密度峰的相对位置见图1。ModFit软件分析表明，小鼠淋巴细胞的荧光密度峰（M2）只有1个G0/G1峰，不表现出细胞周期现象；吉富罗非鱼的红细胞存在2个荧光密度峰，第1个峰值（M1）约占95%左右，为G0/G1期细胞；G0/G1峰值后是1段比例很小的峰谷，约占3.5%左右，为S期；紧接着又有1段峰值约为25%的G2期和M期。
2.2 吉富罗非鱼的细胞核DNA含量
采用流式细胞仪对吉富罗非鱼的血细胞DNA含量进行了测定，详见图1、表1。可以看出吉富罗非鱼血细胞的平均荧光密度值为200.33±11.260 2，小鼠淋巴细胞的平均荧光密度值为590.50±28.302 9，两者比值0.339 2±0.009 0。以小鼠淋巴细胞DNA的绝对含量值7.0 pg/2C作为标准，可以算出吉富罗非鱼的血细胞DNA绝对含量为（2.374 5±0.063 0） pg/2C。
3 讨论
研究鱼类的种质参数、掌握该鱼的种质特征对于人工育种都具有一定的指导意义。DNA含量分析是种质标准中不可缺少的参数之一。近年来测定鱼类细胞DNA含量的方法主要是采用显微分光光度计和流式细胞仪2种方法[11]，从目前的技术水平来看，采用流式细胞仪测定鱼类DNA含量要比采用显微分光光度计法更准确些。流式细胞仪是70年代发展起来的一种利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理化及生物学特性（细胞大小、DNA/RNA、细胞表面抗原表达等）进行相关检测分析的高技术仪器，具有快速、准确、采集数据量大（速度可达1 000～10 000个/s）、分析全面和操作简单等优点，目前已广泛运用于鱼类、虾类等DNA含量和倍性的检测中[12-14]。到目前为止，用流式细胞仪测定鱼类细胞含量的方法已比较完善和普遍。此外，流式细胞仪对样品需求量少，只需要微量鱼血即可，使得对试验鱼的伤害减至最低。
对于同一种生物而言，体细胞的DNA含量是恒定的，具有种的特征，在亲缘关系相近的类群中可以作为探讨其演化地位和亲缘关系的依据[13]。吴洪喜等测定得毛蚶（Scapharca subcrenata Lischke）与魁蚶（Scapharca broughtonii Schrenck）的DNA含量高度一致，表明两者之间的亲缘关系接近，但泥蚶（Arca granosa）的DNA含量则稍高于毛蚶和魁蚶，因此认为泥蚶在进化程度上与毛蚶和魁蚶相近且比它们要高级[14]。方旅平等研究发现，日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）与刀额新对虾（Metapenaeus ensis）DNA含量的绝对值相差不大，因而推知这2种虾在系统发生上具有相近的亲缘关系，这与形态学上的分类系统是一致的[15]。顾若波等研究发现，似刺鳊（Paracanthobrama guichenoti Bleeker）的细胞核DNA含量与同亚科的花（Hemibarbus maculatus Bleeker）接近[16]。本试验利用流式细胞术测得吉富罗非鱼血细胞核DNA含量为（2.374 5±0.063 0）pg/2C，与已报道的尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的（2.27±0.07）pg/2C、奥利亚罗非鱼（O. aureus）的（2.22±0.08）pg/2C[17]和星洲红鱼（Red Tilapia）的（2.46±0.09）pg/2C[18]相近，这与4种罗非鱼亲缘关系接近是一致的。
常见的参照标准有鸡血细胞、人淋巴细胞、小鼠淋巴细胞、鳖血细胞、鳟鱼红细胞及鲑鱼红细胞等[11]。鸡血细胞具有来源丰富、着色性好、大小均匀等优点，并且在大量研究中被广泛应用，而且鸡血细胞与罗非鱼的DNA含量相近，比值接近[17]。采用内标法检测发现，吉富罗非鱼细胞与小鼠淋巴细胞的荧光密度峰值相近，不易区分，如果对照品和测试样品分别上机检测即采用外标法检测时，有可能出现一定的误差。许晓军等报道采用内标法获得的检测结果变异系数小于外标法，并建议选取DNA含量相差较大的物种作为参照标准[19]，因此本试验选取小鼠淋巴细胞作为对照标准，以内标法测定吉富罗非鱼的细胞核DNA含量。
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