中药复方冠心康对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞Bcl2、Bax表达的影响
摘要：目的 观察中药复方冠心康对大鼠缺血再灌注损伤（MIRI）心肌细胞相关凋亡因子Bcl2、Bax表达的影响。方法 40只SD雄性大鼠随机分为假手术组、MIRI模型组、冠心康组、盐酸地尔硫卓组。采用结扎左冠状动脉前降支30 min，再灌注2 h复制大鼠MIRI模型，分别以HE染色、TUNEL法及免疫组织化学法检测心肌组织病理学、心肌细胞凋亡指数、心肌细胞Bcl2、Bax的阳性表达。结果 MIRI组与假手术组比较心肌细胞凋亡指数值显著升高（P<0.01），而冠心康组明显降低（P<0.01）；抑凋亡因子Bcl2在MIRI后表达明显降低，而促凋亡因子Bax表达则明显升高，冠心康可明显升高Bcl2的表达，同时降低Bax的表达（P<0.01）。结论 中药复方冠心康对大鼠MIRI心肌细胞具有明显的保护作用，其作用机制与调控心肌细胞的凋亡因子Bcl2、Bax的表达有关。
关键词：冠心康；缺血再灌注损伤；细胞凋亡；Bcl2；Bax
中图分类号：R329.2 R285.5文献标识码：A文章编号：1672
1） 为上海市卫生局基金资助项目（No.2010214） 随着人口老龄化，冠心病的发病率和死亡率逐年增高，虽然通过溶栓、经皮冠状动脉介入治疗术等各种心肌保护技术，降低了死亡率，但心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）仍无法完全避免。而心肌细胞凋亡是多种心血管疾病发生发展中重要的细胞学基础，大量研究表明，在众多心脏疾病中如心力衰竭、心律失常、心肌病、心肌梗死等都有心肌细胞凋亡的发生[1]。大量的动物实验研究发现，心肌细胞凋亡与MIRI有着密切关系，且凋亡在心肌细胞再灌注过程中起着关键作用[2]。中药复方冠心康具有抗心肌缺血和缓解心绞痛的作用[3]，并能显著缩短豚鼠模拟缺血早期和再灌注早期心肌90%动作电位时程[4]，在此研究基础上，本实验采用大鼠MIRI模型，观察中药复方冠心康对大鼠MIRI心肌细胞凋亡因子Bcl2、Bax表达的影响，并探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠，体重200 g～250 g，共40只，购于上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号SYXK（沪）20100095。所有动物饲养于上海中医药大学附属龙华医院SPF级动物实验中心。
1.2 实验药物 冠心康由黄芪、全瓜蒌、薤白、益母草、丹参、制半夏组成，均购于上海中医药大学附属龙华医院药剂科，并煎成汤剂。盐酸地尔硫卓片（恬尔心），浙江亚太药业股份有限公司生产，产品批号20110303。
1.3 主要试剂 Bcl2、Bax多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品， EnVision试剂（HRP/Rabbit） 即用型丹麦Dako公司产品，Tunel试剂盒、苏木素伊红均购自南京建成科技有限公司，3%戊巴比妥钠、10%甲醛溶液等均为上海威奥生物科技有限公司提供。
1.4 主要仪器 小动物呼吸机：上海奥尔科特技术有限公司；多导电生理仪：PowerLab生物信号采集分析系统为澳大利亚埃德仪器国际贸易有限公司产品；切片机：德国Lico公司产品，型号：RM2145；微波炉：格兰仕WD800SL4Ⅱ；隔水式恒温培养箱：GNP9270上海精宏实验设备有限公司；电热恒温水浴锅：DKS22上海精宏实验设备有限公司。
1.5 实验分组 随机分为4组：假手术组、MIRI模型组、冠心康组、盐酸地尔硫卓组。
1.6 给药时间和方法 术前灌胃7 d，每日灌胃1次。冠心康按生药13 g/（kg·d）灌胃给药。盐酸地尔硫卓按30 g/（kg·d）灌胃给药。假手术组和MIRI模型组分别于相同时间给予等容积的生理盐水灌胃。
1.7 动物模型的建立及评价 于末次给药1 h后，通过结扎大鼠左冠状动脉前降支30 min，再灌注2 h，制备大鼠MIRI模型，以往已有实验证实此缺血再灌注时间足以引起心肌细胞凋亡[5，6]。
将大鼠称重量，3%戊巴比妥钠，0.15 mL/100 g，经腹腔注射麻醉后，仰卧固定。气管插管，连接小动物呼吸机，呼吸频率70次/min～80次/min，潮气量8 mL～12 mL，呼吸气比为1∶2，呼吸压力1.5 kPa～2.5 kPa，同时用多导电生理仪Ⅱ导联记录心电图。胸部脱毛，在心脏搏动最明显处钝性分离肌肉开胸，钝性分离第3、4肋骨间肌肉，用眼科开睑器打开视野，剪开胸膜、心包膜，充分暴露心脏。在左心耳下（相当于肺动脉圆锥与左心耳之间，距主动脉根部2.5 mm～3 mm处），用40带线缝合针线穿过一小束心肌，将硅胶管置于结扎线与血管之间，拉紧结扎线，使硅胶管压迫冠状动脉左前降支而至闭塞，亦便于切断结扎线再通。结扎后左室壁局部变苍白，心电图出现QRS波群变宽大畸形者为结扎成功。缺血30 min后，松解结扎线实现冠脉再灌注。再灌注后，可见左室壁苍白部分逐渐红润，心电图上宽大畸形的QRS波群变窄，波幅下降，提示再灌注成功。假手术组同样手术但不结扎冠脉。
1.8 取材及检测指标 造模成功后，将大鼠处死，剪取心脏，生理盐水冲洗，在MIRI区域取材，作为组织标本。用10%甲醛液固定12 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，检测指标如下。
1.8.1 心肌组织病理学 切片厚度为4 μm，常规苏木素伊红（HE）染色。
1.8.2 心肌细胞凋亡的原位标记检测 采用TUNEL法并严格按照试剂盒说明书操作。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片随机选择5个非重叠视野（400倍），计数阳性染色的心肌细胞数及心肌细胞总数，计算细胞凋亡指数（AI），AI=阳性细胞数/心肌细胞总数×100%。
1.8.3 免疫组化检测Bcl2、Bax的表达 按照EnVision法进行免疫组化检测，简要步骤为：石蜡切片常规脱蜡至水，PBS冲洗3 min×3次，用pH6.0 的0.01 mol/L柠檬酸缓冲液热诱导修复（微波3档，20 min），然后室温自然冷却，PBS冲洗3 min×3次，经0.3%H2O2室温下20 min后，PBS冲洗3 min×3次，后经20%正常羊血清室温孵育30 min，滴加抗Bcl2或Bax 后37 ℃孵育2 h，PBS冲洗3 min×3次，之后用EnVision试剂37 ℃ 30 min，PBS冲洗3 min×3次，DAB显色8 min～12 min，苏木素染色，热水蓝化，在显微镜250倍下用图形分析系统定量观察。
1.9 统计学处理 实验数据以均数±标准差（x±s）表示。数据采用SPSS 18.0统计软件进行分析，用组间t检验。
2 结 果
2.1 心肌组织病理学改变 HE染色（光学显微镜×200倍）：假手术组心肌细胞排列整齐，细胞核居中，细胞膜完整，细胞着色均匀；MIRI模型组心肌细胞排列紊乱，部分区域有断裂，细胞核固缩，细胞着色不均匀，区域性水肿变性明显；冠心康组心肌细胞排列基本整齐，细胞着色相对均匀，水肿变性不明显；盐酸地尔硫卓组心肌细胞排列疏松，细胞着色不均匀，水肿变性稍明显。
2.2 心肌细胞凋亡指数 光镜下观察，心肌细胞核呈蓝色，而心肌凋亡阳性细胞的细胞核为深浅不一的棕褐色。结果显示：与假手术组比较，MIRI模型组心肌细胞凋亡指数值显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与MIRI模型组比较，冠心康组和盐酸地尔硫卓组明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。详见表1。
3 讨 论
MIRI可诱导心肌细胞坏死，同时也可导致心肌细胞凋亡。1994年Gottlieb等[7]首先在兔心脏上发现再灌注损伤促进了细胞凋亡。随着分子心脏病学研究的不断深入，越来越多的证据表明细胞凋亡基因的调控在MIRI的病理生理过程中发挥着重要作用。
目前研究的凋亡调控基因主要为Bcl2家族、Caspase家族、细胞色素C、凋亡诱导因子、p53等。其中Bcl2基因家族是心肌细胞凋亡过程中极其重要的调节因子[8]。Bcl2家族蛋白根据其功能主要分为两大类：抑细胞凋亡因子，以Bcl2、BclxL为代表；促细胞凋亡因子，以Bax、Bad、Bak、Bid为代表。Bcl2基因家族成员自身或与Bax彼此之间可形成二聚体或多聚体，通过蛋白蛋白相互作用调节细胞的存活或凋亡。Bcl2蛋白主要定位于线粒体外膜，起抑制凋亡的作用。而具有促凋亡作用的Bax蛋白则主要定位细胞质，当细胞受到凋亡因子的诱导，便向线粒体转位。Bcl2和Bax相互竞争，间接调节蛋白酶和核酸酶活性，从而双相调节细胞凋亡。当Bax表达占优势时促进细胞凋亡，而Bcl2表达占优势时则阻止细胞凋亡，因此有学者将Bcl2和Bax称为心肌细胞的“死亡开关”[9，10]。
冠心病在祖国医学中属于“胸痹”范畴，责之于本虚标实。MIRI是冠心病的一个病理环节，常见临床表现主要为胸痛、胸闷、短气、乏力等。中医病机以气虚痰浊血瘀多见。中药复方冠心康以《金匮要略》中栝楼薤白半夏汤为基础加减化裁而成。全方以黄芪为君，丹参、益母草为臣，补气生血、活血祛瘀；佐以全瓜蒌、薤白、半夏，燥湿化痰、通阳解秽。前期研究发现其具有明显的调脂、抗心肌缺血、缓解心绞痛的作用，深入研究发现本方可进一步开放离体大鼠MIRI心肌KATP通道，可明显增加Ca2+Mg2+ATP酶、Na+K+ATP酶活性，抑制Ca2+超载、减轻Ca2+内流；能够明显促进超氧化物歧化酶（SOD）的产生，有效清除氧自由基作用[11，12]。本实验采用大鼠MIRI模型，发现中药复方冠心康组心肌细胞凋亡指数显著降低，同时，抑凋亡因子Bcl2的表达明显升高，而促凋亡因子Bax的表达则明显降低。
综上所述，中药复方冠心康可明显减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤，其作用机制是通过调控心肌细胞的凋亡基因而发挥保护作用，但是，中药复方的作用机制是多靶点的，是否还通过其他机制起到保护作用，仍需要进一步深入探讨研究。
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