芪连扶正胶囊干预肺癌干细胞白细胞介素10、转化生长因子β1表达对免疫重塑的影响
摘要目的：观察芪连扶正胶囊干预肺癌干细胞免疫相关因子白细胞介素10（IL10）、转化生长因子β1（TGFβ1）表达对其免疫重塑的影响。方法：选取体外常规培养肺癌A549细胞，免疫磁珠法分选干细胞，制备芪连扶正胶囊含药血清，按实验分组干预，免疫酶联吸附试验法检测各组IL10、TGFβ1的表达，RTPCR法检测各组IL10 mRNA、TGFβ1 mRNA的表达。结果：对照组、芪连扶正胶囊组、顺铂组、芪连扶正胶囊+顺铂组的IL10表达依次为（11903±699）%，（10891±807）%，（9671±578）%，（5641±795）%；TGFβ1表达依次为（17479±795）%，（16051±803）%，（14128±697）%，（9734±763）%；IL10mRNA表达依次为（106±019）%，（085±018）%，（067±016）%，（047±012）%；TGFβ1mRNA表达（127±026）%，（101±020）%，（077±014）%，（050±010）%。结论：芪连扶正胶囊可降低肺癌干细胞IL10、TGFβ1表达，改善细胞免疫抑制状态，调节免疫重塑，进而抑制肺癌转移。
关键词芪连扶正胶囊；肺癌；干细胞；肿瘤转移；免疫重塑；免疫逃逸；白细胞介素10；转化生长因子β1
Effects of Qilian Fuzheng Capsule on the Immune Remodeling by Interfering with the Expression of IL10 and TGFBeta 1 in Lung Cancer Stem Cells
Li Huijie，Qi Yuanfu，Li Xiurong，Zhang Yingying
（The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014，China）
AbstractObjective：To observe the effects of Qilian Fuzheng Capsule on the immune remodeling by interfering with the expression of IL10 and TGFβ1 in lung cancer stem cells.Methods：We cultured the lung cancer A549 cells in vitro，sorted the stem cells by immunomagnetic beads，and prepared the serum containing of Qilian Fuzheng Capsule.According to the experimental group intervention，the expression of IL10 and TGFβ1 in each group was detected by Elisa，and the expressions of IL10mRNA，TGFand 1mRNA in each group were detected by RTPCR.Results：In the control group，Qilian Fuzheng Capsule group，cisplatin group，Qilian Fuzheng capsule+cisplatin group，IL10 expression levels were （11903±699）%，（10891±807）%，（9671±578）%，（5641±795）%； TGFβ1 expression levels were （17479±795）%，（16051±803）%，（14128±697）%，（9734±763）%； IL10mRNA expression levels were （106±019）%，（085±018）%，（067±016）%，（047±012）%； TGFβ1mRNA expression levels were （127±026）%，（101±020）%，（077±014）%，（050±010）%.Conclusion：Qilian Fuzheng Capsule can reduce the expression of IL10 and TGFβ1 in lung cancer stem cells，improve the cellular immune suppression status，regulate immune remodeling and inhibit lung cancer metastasis.
Key WordsQilian Fuzheng Capsule； Lung cancer； Stem cell； Tumor metastasis； Immune remodeling； Immune evasion； IL10； TGFβ1
中圖分类号：R273；R2895文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.037
肿瘤干细胞是肿瘤组织中存在的小部分具有自我更新能力和分化潜能的细胞，是肿瘤发生、转移和复发的根源[1]。肿瘤转移过程中存在免疫逃逸现象，而免疫重塑是最终导致逃逸的关键[2]。免疫重塑的肿瘤细胞能过度产生抑制性细胞因子如白细胞介素10（IL10），转化生长因子β1（TGFβ1）等，并诱导产生调节性T细胞、抑制性巨噬细胞，在肿瘤局部形成免疫抑制的肿瘤微环境[3]。中医药在改善机体免疫功能、提高患者生命质量方面彰显优势，本研究观察芪连扶正胶囊对肺癌干细胞免疫相关因子IL10、TGFβ1表达的影响，探讨其对肺癌干细胞免疫重塑的影响，以期为抑制肺癌转移及肺癌治疗提供实验依据。
1材料与方法
11材料
111细胞与动物细胞为山东中医药大学附属医院中心实验室惠赠的人肺腺癌细胞系A549细胞株。动物为SPF级体重±200 g、雄性SD大鼠，购买于济南朋悦实验动物繁育有限公司（质量合格证号SCXK（鲁）20140007），饲养于山东中医药大学附属医院中心实验室SPF动物房。
112主要药物芪连扶正胶囊（山东中医药大学附属医院，批号Z01080226），注射用顺铂（齐鲁制药有限公司，批号H20023461）。
113试剂与仪器
主要试剂：RPMI1640培养基及胎牛血清（天津市灏洋生物制品科技有限公司）、免疫酶联吸附试验法（ELISA）检测试剂盒（南京巴傲得生物科技有限公司）、CD133细胞分离试剂盒、PE标记的CD133抗体（美国Gene Copoeia公司）、反转录试剂盒（TaKaRa公司）、RNA引物（生工生物工程股份有限公司，IL10上游5′TTACCTGGAGGTGATGC3′、下游5′GGGAAGAAATCGATGACAGC3′；TGFβ1：上游5′GTACCTGAACCCGTGTTGCT3′，下游5′GTATCGCAGGAATTGTTGC3′；GAPDH上游5′AGAAGGCTGGGGCTCATTTG3′，下游5′AGGGGCCATCCACAGTCTTC3′）。
主要仪器：ClassⅡ2085型超净工作台、Multiskan Go酶标仪（美国Thermo Forma公司），BB5060UV型CO2培养箱（德国Heraeus公司），Axiovert 40型倒置相差显微镜（德国蔡司），流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司），TransBlot Turbo转膜仪、电泳系统（美国Biorad公司），Innotech Fluor Chem Q成像分析系统（美国Alpha公司），96孔型PCR仪（美国Therm Fisher公司），LightCycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪（美国ROCHE公司）。
12方法
121分组与模型制备
实验分组：分为对照组（10%胎牛血清）、芪连扶正胶囊组（芪连扶正胶囊含药血清）、顺铂组（终浓度为2 μg/mL的顺铂溶液）、联合组（芪连扶正胶囊含药血清+顺铂溶液）。
含药血清制备：购买体重±200 g的雄性SD大鼠适应性喂养5 d；随机分为芪连扶正胶囊组及对照组，芪连扶正胶囊组大鼠灌胃应用芪连扶正胶囊溶液，对照组应用等量生理盐水，灌胃1次/d、连续灌14 d；末次灌胃前12 h禁食，末次灌胃后1 h 10%水合氯醛麻醉大鼠；经腹主动脉取血，离心取血清，022 μm微孔滤膜过滤，保存于-80 ℃冰箱备用。
肺癌干细胞分选：常规培养细胞，消化离心收集细胞，调整细胞浓度、清洗、加入、缓冲液重悬细胞，按照CD133细胞分离试剂盒说明逐步进行，流式细胞仪检测阳性细胞的百分率，分选的CD133+比例为8079%，可用于后续实验。
122干预方法
肺癌干细胞常规培养，待细胞生长到80%左右，按实验分组进行干预，48 h后收集细胞进行相关指标测定。
123检测指标与方法
酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL10、TGFβ1：常规培养细胞，按实验分组干预，继续培养48 h，离心收集，保存于-80 ℃冰箱备用；检测时，配制标准品，加样，封板温育30 min，洗板，加酶标试剂，重复后加显色剂，震荡混匀，避光显色15 min，加终止液，酶标仪450 nm波长下测定各孔吸光度值（A值），计算数据。
RTPCR法检测IL10mRNA、TGFβ1mRNA：常规培养细胞，按实验分组加药，继续培养48 h，逐步提取总RNA，测定RNA浓度，标准内进行后续实验；逐步合成cDNA，PCR扩增，上机检测，根据公式2-△△CT处理实验数据。
13统计学方法采用SPSS 190统计软件处理数据，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，以P<005为差异有统计学意义。
2结果
21肺癌干细胞IL10、TGFβ1表达情况
与对照组比较，各药组均可降低细胞IL10和TGFβ1的表达（P<005）；与顺铂组比较，芪连扶正胶囊组及联合组的IL10和TGFβ1表达均与之差异有统计学意义（P<005）。见表1。
22肺癌干细胞IL10mRNA、TGFβ1mRNA表达
与对照组比较，各用药组均可降低细胞IL10mRNA、TGFβ1mRNA表达（P<005）；与顺铂组比较，芪连扶正胶囊组IL10mRNA表达差异无统计学意义（P>005）、而联合组较之差异有统计学意义（P<005），TGFβ1mRNA表达差异有统计学意义（P<005）。见表2。
3讨论
肿瘤干细胞是存在于肺癌细胞中的一个亚群，具有高度自我更新及无限增殖能力，研究证实其与肿瘤发生、侵袭、转移及复发密切相关[4]，是肺癌恶性表型的根源和潜在的治疗靶点，肺癌也不例外[5]。肿瘤的发生发展涉及到肿瘤细胞与机体免疫系统相互作用的复杂过程，当机体发生肿瘤时，肿瘤细胞可使自身不被免疫效应细胞杀伤即免疫逃逸[6]，加之其分泌免疫抑制因子可改变肿瘤抑制的微环境、介导肿瘤细胞逃避免疫系统攻击，促进肿瘤发生与生长[7]。且机体免疫系统具有抗肿瘤的保护功能，以及对肿瘤的重新塑型功能，我们将后者称之“免疫重塑”，即免疫系统不断杀伤较高免疫原性的肿瘤细胞，同时忽略低免疫原性的肿瘤细胞，逐渐出现免疫原性更低、惡性程度更高的肿瘤表型，并在体内存留下来的过程[8]。免疫重塑不但可以影响机体免疫系统对肿瘤进行重塑与编辑，亦可改变机体免疫系统相关成分，从而更利于肿瘤免疫逃逸的形成，以及肿瘤的浸润转移。免疫重塑的肿瘤细胞能产生大量抑制性细胞因子，如IL10、TGFβ1等，其通过直接接触及诱导该类因子削弱细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic Lymphocyte，CTL）、自然杀伤细胞的杀伤活性，进而逃逸机体免疫监视，促进肿瘤转移[910]。其中，IL10是参与肿瘤免疫逃逸的重要免疫抑制因子，具有双向免疫调节特性，其介导免疫抑制机制是通过作用于不同免疫细胞亚群多途径发挥免疫抑制，促进机体抗肿瘤免疫逃逸[11]。而TGFβ1可直接或间接作用于免疫细胞，诱导其功能缺失，帮助肿瘤逃避机体免疫监视功能，促进肿瘤发展[12]；另外，TGFβ1可促进肿瘤组织血管生成、加速肿瘤细胞和外基质之间相互作用，抑制机体免疫，加速肿瘤生长及浸润转移[13]。有研究证实IL10、TGFβ1参与肺癌患者肿瘤微环境构成，是肺癌患者免疫应答受到抑制的原因之一，促进了肺癌的发生发展及转移，并强调两者可作为监控肺癌患者免疫功能的参考指标[14]。
芪连扶正胶囊是我院研发的抗肿瘤自制剂，前期临床研究观察了芪连扶正胶囊对化疗患者免疫功能的影响，结果显示：芪连扶正胶囊组提高白细胞及中性粒细胞计数明显，有效率高达9429%，T淋巴细胞亚群及自然杀伤细胞活性亦较对照组改善明显，可保护机体免疫功能[15]；芪连扶正胶囊联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌可改善患者大部分临床症状，提高生命质量，保护机体免疫功能，降低肿瘤标志物CEA与CA125水平，减轻血液和消化道不良反应，具有增效减毒作用[16]；其维持治疗晚期非小细胞肺癌的具有可行性，可延长患者无疾病进展生存期[17]。实验研究证实芪连扶正胶囊可增加荷瘤小鼠的免疫器官质量，改善小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，提高荷瘤小鼠的自然杀伤细胞活性；芪连扶正胶囊可提高细胞表面共刺激分子B71、B72的表达，促进T细胞活化，增强细胞免疫功能[18]；芪连扶正胶囊可通过调控TGFβ1抑制肺癌A549细胞增殖侵袭及上皮间质转化的发生。前期研究从不同角度证实芪连扶正胶囊具有提高机体免疫力、抗肿瘤侵袭转移作用，但具体机制有待进一步阐明。本研究观察了芪连扶正胶囊含药血清对肺癌干细胞免疫相关因子IL10、TGFβ1表达的影响，结果显示芪连扶正胶囊可降低IL10、TGFβ1的蛋白及基因表达，与对照组比较有显著性差异，降低程度虽不及顺铂，但与顺铂有协同作用。
综上所述，肺癌干细胞是肺癌转移的根源，免疫重塑加速肺癌转移，IL10、TGFβ1是免疫逃逸的重要分子，在免疫重塑过程中发挥重要作用，而芪连扶正胶囊可通过降低IL10、TGFβ1表达改善细胞免疫抑制状态，进而发挥调节免疫重塑、抑制肺癌转移的作用。基于此，进一步探寻中医药免疫治疗靶点可为抑制肺癌转移及肺癌综合治疗提供新策略。
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（2017-10-29收稿责任编辑：杨觉雄）