局部miR—126基因治疗促进小鼠缺血后肢血管新生的观察
[摘要]目的：通过体外构建重组腺病毒miR-126，应用于小鼠缺血后肢腓肠肌局部治疗，观察miR-126对缺血局部具有促血管新生作用。方法：重组腺病毒miR-126包装 、纯化、滴度的鉴定；C57小鼠随机分为A组（C57左侧缺血后肢手术组）、B组（空病毒C57左侧缺血后肢手术组）、C组（重组腺病毒miR-126 C57左侧缺血后肢手术组）三组，制作小鼠缺血后肢模型，术后即刻将重组腺病毒miR-126和腺病毒各50μl局部注射于小鼠缺血左后肢腓肠肌。分别于3、7、14天各组（3只）取左后肢腓肠肌做HE染色、CD31免疫组化染色、western blot检测Akt、ERK1/2、pAkt、pERK1/2蛋白水平以及实时定量PCR检测等。结果：各种检测结果显示C组较A、B两组血管内皮细胞增生明显，新生血管数目计数明显增多，miR-126表达水平明显增高，尤其在第7天升高最为明显，以及VEGF、bFGF等介导的IP3和MAPK信号通路中ERK1、pERK1、AKT和 pAKT蛋白水平表达明显增高。结论：miR-126局部应用于缺血后肢，通过激活Akt、ERK1/2的相关通路，促进血管新生，利于缺血后肢功能恢复。
[关键词]miR-126；缺血后肢；血管新生；Akt；ERK1/2；
[中图分类号]R318 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）10-0-0
microRNA是新近发现的一类长约19-25个核苷酸的内源性微小RNA，通过与靶mRNA的5"或3"端的非编码区互补结合而使靶mRNA翻译抑制或降解[1]。 miR-126位于染色体9q34.3的宿主基因Egfl7（上皮生长因子-7）[2]，在内皮细胞中特异性高表达，调节内皮细胞生物功能的诸多方面，包括内皮细胞的增殖、迁移、细胞骨架的形成、毛细血管网的稳定以及细胞的存活等等，表明它是活体中维持功能性血管结构的前提，对血管新生起着至关重要的作用，展示了良好的应用前景[3-4]。
本实验通过体外构建重组腺病毒miR-126，局部应用于小鼠缺血后肢，观察其在局部表达情况的变化，以及促缺血局部血管新生的作用，从而及早、有效的促进缺血后肢功能的恢复情况，探索miR-126基因治疗在临床上应用的可行性。
1 材料
1.1 实验动物：C57小鼠，雌性，12周，购于第四军医大学实验动物中心。
1.2 仪器：显微外科手术器械、显微外科显微镜、酶标仪、电泳电源、电泳器材、转膜电源、半干转器材、滚筒架、发光仪、荧光定量PCR仪、凝胶成像系统（美国UVP）、水平电泳槽、超净工作台、干燥消毒烤箱、紫外分光光度计、台式离心机、低温高速离心机。
1.3 试剂：CD31抗体（Abcam）、二抗（Elvision法）、DAB显色液、裂解液、ERK1/2抗体、、AKT抗体、pERK1/2抗体、pAKT抗体、转膜液、发光液（Santa Cruz）、丽春红染料、封闭液、NC膜、电泳液、SDS凝胶试剂、GADPH、RT-PCR引物合成 （ABI，北京）、RNasin （Promega，美国）、M-MLV （Promega，美国）、SYBRR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，日本）。
2 方法
2.1 重组腺病毒miRNA-126包装 、纯化、滴度的鉴定：根据mus-mir-126 的基因信息， 设计上、下游引物如下：
以小鼠基因组DNA为模板扩增mus-mir-126 基因；全基因合成mus-mir-126 基因至PES 载体上；小鼠mus-mir-126基因克隆至pacAd5 CMV-IRES-GFP 载体上；质粒扩增、鉴定及线性化；重组腺病毒的包装；用滴定法测定重组腺病毒滴度。
2.2 实验动物分组：C57小鼠随机分为3组，每组12只：A组、C57左侧缺血后肢手术组；B组、空病毒C57左侧缺血后肢手术组；C组、重组腺病毒miRNA-126 C57左侧缺血后肢手术组。
2.3 C57小鼠左后肢缺血模型的构建：在显微外科镜下，小鼠左侧腹股沟处暴露股动脉深、浅支，近、远端结扎，中间离断，缝合伤口。
2.4 给药方法：空病毒组、重组腺病毒miRNA-126组用1ml注射器对左后肢腓肠肌局部注射，滴度为1×109OPU/ml，各50μl，按组分笼喂养。
2.5 检测指标：
2.5.1 大体观察：各组0～14天末梢血运状况的观察。
2.5.2 组织学检测：7天、14天分别取左后肢腓肠肌组织，进行HE 染色、血管内皮细胞的CD31 染色，计算血管数目、密度。
2.5.2.1 石蜡切片常规HE染色。
2.5.2.2 CD31染色（Elivision法）：选取5μm厚的石蜡切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，压力锅进行抗原修复，灭活内源性过氧化物酶30min，10%山羊血清封闭液37℃温育15min，PBS冲洗，滴加稀释兔抗鼠CD31一抗（Abcam 1：250）4℃过夜，PBS冲洗，滴加二抗37℃温育30min，冲洗、滴加新鲜配制的DAB显色液，苏木素复染，中性树胶封片，阅片。
2.5.3 实时定量PCR检测：各组C57小鼠第3、7、14天处死（各组每次3只小鼠），取左后肢腓肠肌组织做miR-126基因水平检测。RNA的提取；实时定量荧光PCR反应上下游引物设计；取5ug RNA运用Promega MMLV逆转录酶及相关试剂进行逆转录反应，反应体系为20μl；取0.5μl RT产物 运用SYBR？ Premix Ex TaqTM （TaKaRa） 进行实时定量PCR反应；数据处理。
2.5.4 Western blotting 检测分析：各组C57小鼠第14天处死，取左后肢腓肠肌组织ERK1/2、、AKT、pERK1/2、pAKT蛋白水平检测。取出-80℃冰箱中的组织，解冻，称取约20mg左右的小鼠腓肠肌组织加入裂解液，离心，提取蛋白；蛋白定量（BCA法）；采用SDS凝胶试剂盒配制12%的分离胶和3%的浓缩胶，上样，跑电泳，90V，130V，90min；使用半干转的方法转膜，从下至上超厚滤纸、NC膜、胶、超厚滤纸的顺序组装，设置25V，30min；丽春红染色，封闭，将NC膜放入稀释液配制的一抗ERK1/2（1：1000）、、AKT（1：1000）、pERK1/2（1：1000）、pAKT（1：1000）的试管（50ml）中，试管固定于滚筒架上4℃过夜，洗膜，加二抗，山羊抗兔二抗（1：2000，用于ERK1/2、AKT、pERK1/2、pAKT检测），山羊抗小鼠二抗（1：2000，用于GAPDH检测）室温孵育1小时；配置发光液，在发光仪中发光，western分析软件、统计软件分析结果。
2.6 统计学方法：统计结果用SPSS13.0统计学软件进行分析，以平均值±标准差表示，两两均数比较用t检验，多组均数比较用单因素方差分析。
3 结果
3.1 重组腺病毒microRNA-126构建、纯化、滴度测定：见表1。重组腺病毒包装、扩增后，应用滴定法测定病毒的滴度（TCID50）。
病毒TCID50 为：T=101+d（9.5-0.5）=101+1×（9.5-0.5）=1.00×1010TC ID50/ml，换算为病毒的PFU 滴度为：T=1010-0.7=109.3=2.00×109（PFU/ml），用时稀释成1.00×109（PFU/ml）。
3.2大体观察：各组0～14天从外形皮色、皮温及肌肉萎缩状况观察，三组0～7天差别不很明显。7～14天A、B组较C组相对皮色淤青明显、肌肉有轻度萎缩、后肢中段周经测量稍小，平均相差约0.5mm。
3.3 组织学检测
3.3.1 HE染色：第7天C组：低倍镜下萎缩纤维中有再生肌纤维，无明显新生血管；高倍镜见内皮细胞肿胀明显，有明显的血管芽，个别有新生血管腔形成；A组：低倍镜下肌萎缩明显，高倍镜见内皮细胞扁平，呈梭形；B组：低倍镜下肌萎缩明显，炎症明显，高倍镜见内皮细胞扁平，呈梭形。图1～3。
第14天C组低倍镜血管肉芽组织增生，有大量新生血管增生，高倍镜下血管内皮细胞肿胀、增生，有大量血管腔形成；A组低倍镜有肌萎缩，未见明显肉芽组织增生，高倍镜有少量血管内皮细胞增生，少见新生血管形成；B组低倍镜有肌萎缩，未见明显肉芽组织增生，高倍镜有少量血管内皮细胞增生，少见新生血管形成。图4～6。
3.3.2 CD31免疫组化染色：第7天高倍镜下C组较A、B组CD31标记的内皮细胞增生明显，有血管芽形成，未见明显新生血管腔。图7～9。
第14天低倍镜下C组较A、B组CD31标记的内皮细胞增生明显，有大量血管芽形成及明显多的新生血管腔形成。结果表明C组的标记CD31阳性的血管内皮细胞较A、B组明显增多。图10～12。
3.4 实时定量PCR检测miR-126的表达水平：①Cr：重组腺病毒miR-126 C57小鼠右侧后肢组；②阴：正常C57小鼠左后肢组；③A：C57小鼠左侧缺血后肢手术组；④B：空病毒C57小鼠左侧缺血后肢手术组；⑤Cl：重组腺病毒miR-126 C57小鼠左侧缺血后肢手术组。图13。
设阴性组3天的miR-126的表达量设为1，各组数据为相对表达量，即平均值±标准差。统计分析采用Student"s t test。阴性组与Cr组在3day，7day，14day均无统计学意义（P>0.05）。阴性组与A、B、Cl组均有统计学意义（P<0.05）。A组与B组在3天，7天，14天均无统计学意义（P>0.05）。Cl组在3天，7天，14天与其他组均有统计学意义（P<0.05）。
结果表明A组缺血组织中的miR-126水平在术后明显降低，尤其第7天，降低最明显，14天有回升，但未及正常水平。C组术后miR-126水平呈上升趋势，尤其是第7天达最高水平，14天水平有回落，但仍高于正常水平。这与组织学检测的结果正好相符。Cr组的miR-126水平与阴性组相一致，说明体外重组腺病毒miR-126局部注射于小鼠缺血后肢，可以明显增加缺血局部组织中miR-126水平的表达，而不影响其它部位miR-126的水平。
3.5 western blotting监测分析：见图14。各组数据为相对表达量，即平均值±标准差。统计分析采用Student"s t test（*P<0.05，**P<0.01）。
结果显示C组较B组、A组中ERK1/2、、AKT、pERK1/2、pAKT的蛋白表达水平明显增高。表明缺血组织局部被动高表达miR-126，可以明显的增加ERK1/2、、AKT、pERK1/2、pAKT蛋白水平的表达，说明miR-126是激活了VEGF、FGF等生长因子介导的MAPK和PI3的信号通路。
4 讨论
组织移植是整形外科和烧伤外科等学科临床上最常用的治疗手段，移植组织术后存活的基本条件是在移植组织耐缺血时限之内及时重建血液循环，血运重建的时间和质量与移植组织的存活及存活质量有密切的关系。
临床实践中组织移植术后，移植的组织通过与受区重建血液循环而存活。通常较薄的组织（如皮片移植）和体积较小的组织（如少量的颗粒脂肪移植）比较容易建立血运而易于存活，而较厚的组织（如真皮下血管网皮片移植）和体积较大的组织（如大量脂肪注射、大块的组织工程组织移植），往往因为不能在耐缺血时间内及时、有效的重建血液循环而不易存活，这也就是真皮下血管网皮片移植、大量脂肪移植等，目前在临床广泛应用中面临的巨大难题，因此移植术后能否及时、有效的重建血运是提高移植组织存活率和存活质量的关键。另外，冠心病、脑梗死、肢端缺血性坏死等缺血性病变仍是临床上十分常见的疾病，这些缺血疾病转归的关键也是及时、有效的重建血运。重建血运的重要途径就是促进缺血局部的血管新生，改善缺血局部血供，利于缺血局部功能恢复。
血管新生主要是由于机体受到各种病理或生理上的刺激，如组织再生、缺血、缺氧，炎症，以及肿瘤生长等因素，引起内皮细胞增殖、迁移、成熟等，从而形成新的血管。内皮细胞是维持血管系统的基本单位，也是新血管形成的前提、重要条件。
miR-126是近年来发现，在内皮细胞中特异性高表达，在转录后水平，调节功能性血管形成的重要因素。Fish J.E等[3]、Wang S等[4]的研究表明在胚胎发育过程中敲除 miR-126基因，由于引起血管内皮细胞功能异常，出现血管渗漏、内出血以及胚胎致死等。Coen van Solingen等[5]通过在活体外构建miR-126拮抗剂，单次大剂量通过静脉用于左后肢缺血鼠中，检测血管数目较对照组明显减少，进一步证实了miR-126拮抗剂对血管形成和动脉生成有明显的抑制作用。说明miR-126正常水平的维持是功能性血管形成的前提及重要的条件。
本实验发现在小鼠缺血后肢中，miR-126的水平较正常后肢明显降低，依此设想通过体外基因包装技术被动提供缺血局部miR-126的表达水平，就可以促进缺血局部功能性血管新生，加快缺血局部功能的恢复。
本实验设计通过体外以小鼠基因组DNA 为模板扩增mus-mir-126 基因，经重组腺病毒包装、纯化、滴度检测，局部注射于小鼠缺血后肢的腓肠肌，结果显示缺血局部miR-126的表达水平明显提高，说明基因病毒包装技术的成熟与有效，以及局部注射基因方法的可行性。
在本实验中发现缺血局部被动高表达miR-126，不会对其他部位或组织中miR-126水平造成影响，从而确保了miR-126基因治疗的安全性、高效性。
在本实验中缺血局部高表达miR-126，可以通过激活VEGF、bFGF介导的MAPK（ERK1/2）和PI3（AKT）的信号通路，明显的促进缺血局部的血管新生。AKT和ERK1/2是MAPK和PI3信号通路中的关键蛋白，ERK1/2、、AKT、pERK1/2、pAKT表达水平的明显升高，说明MAPK和PI3信号通路的激活。在之前的研究中发现，spred-1[6]和PIK3R2（p85β）[7]是MAPK和PI3信号通路的抑制分子，同时也是miR-126的靶向mRNAs，miR-126在转录后水平，靶向的抑制或降解spred-1和PIK3R2（p85β）mRNAs[3-4]。所以缺血局部高表达的miR-126，靶向的抑制或降解spred-1和PIK3R2（p85β）mRNAs水平，解除其对MAPK和PI3信号通路的抑制，激活并促进MAPK和PI3信号通路的传导，引起血管内皮细胞的增殖、分化、迁移及成熟等，促进缺血局部的血管新生，改善缺血局部的血供，利于缺血局部功能及早恢复。
miR-126还靶向抑制VCAM-1（血管细胞粘附分子1）mRNA[8]，VCAM-1是通过内皮细胞分泌的细胞粘附分子，而miR-126可以抑制内皮细胞表面VCAM-1的表达，减少炎细胞（主要是白细胞）与内皮细胞的粘附，减少局部炎症作用的发生，降低并发症，促进血管新生的作用。
对于miR-126机制的研究不断深入，Stefania nicoli等[9]（2010）在斑马鱼的胚胎发育过程中，观察到血流对于主动脉弓的血管形成非常重要，而且表明主动脉弓的血管形成是通过血流刺激、诱导的基因通路形成的，这种基因通路是机械敏感性锌指转录因子klf2a诱导内皮细胞特异性microRNA-miR-126激活Vegf介导的信号通路，来促进主动脉弓的血管形成，且证明在斑马鱼胚胎的主动脉弓血管形成的生理发育过程中，klf2a是miR-126的上游分子。
虽然目前对于miR-126的研究，在血管新生、肿瘤[10-12]等方面已有不少发现，但有关机制方面仍存在许多未知。本实验通过体外构建重组腺病毒miR-126，缺血局部注射基因，观察到缺血局部miR-126的表达水平明显提高，缺血局部血管新生作用明显的增强，这使将来过渡到临床应用成为可能。
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[收稿日期]2012-06-25 [修回日期]2012-08-21
编辑/张惠娟