p38MAPK及其信号通路在鼻息肉中的作用
【摘要】:目的:研究p38MAPK及其信号通路在鼻息肉发病中的作用机制,以便更加深入的阐明鼻息肉的发病机制,为临床治疗鼻息肉及寻找特异性治疗药物提供理论依据。方法:选取20例未采用糖皮质激素治疗的复发性鼻息肉组织标本、20例初发鼻息肉组织标本、20例正常鼻黏膜组织。实验分为三组:A组:复发性鼻息肉组;B组:初发性鼻息肉组;C组:正常下鼻甲黏膜组,每组各20例。处理因素:体内为布地奈德;体外为布地奈德、克拉霉素和p38MAPK特异性抑制剂SB203580。按1997海口标准进行临床分期分型。上述标本部分于-70℃冻存备用,(1)采用HE染色和免疫组化染色对鼻息肉和正常鼻黏膜组织中的p38MAPK蛋白进行观测并拍照,并用JD109或JD801图像分析系统进行图像分析,测定阳性细胞数密度和灰度值。(2)按常规Western-blot实验操作步骤。结果判定:凝胶图像分析系统对比p38MAPK与GAPDH灰度比值。实验分体内和体外两个阶段。以P<0.05为差异有统计学意义。结果:p38MAPK在正常下鼻甲黏膜组织中无或极少量表达,在鼻息肉组织中均显示高表达(P<0.01);复发型鼻息肉组织p38MAPK的阳性表达面积和密度均高于II型鼻息肉组(P<0.05)。结论:(1)p38MAPK在鼻息肉组织中高表达,而且在复发性鼻息肉组织中表达更显著。(2)结果表明p38MAPK信号通路参与鼻息肉的发生发展。
【关键词】:鼻息肉;p38MAPK;免疫组织化学
【中图分类号】R765.9【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)06-052-2
鼻息肉是一种常见病,发病率及复发率均较高,目前治疗最有效的方法为鼻内镜手术加糖皮质激素治疗,但是治疗后仍有20%左右复发,是鼻科目前治疗的难点。多种炎症因子的表达和EOS的作用是鼻息肉发生的重要环节[1]。
随着免疫学和分子生物学等学科的飞速发展,研究证明参与鼻息肉病理过程的化学介质多达数十种甚至上百种。其中细胞因子(cytokines)的作用倍受重视。细胞因子是由机体的免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌,具有较强的生物活性,广泛存在于鼻息肉的微环境中。目前认为鼻息肉主要是由多种细胞因子参与的一种持续性炎症反应。p38MAPK信号通路是新近阐明的参与炎症机制的信号通路之一,可能在鼻息肉中起至关重要的介导TNF-α与COX-2的信号传导作用。
鼻息肉的发病机制中可能也存在经p38MAPK信号传导通路信号的干预和调控。目前相关文献中对p38MAPK信号传导通路在鼻息肉中的作用研究很少。有研究发现,p38MAPK在鼻息肉组织中的黏膜上皮、腺上皮和血管的周围出现异常表达,且核内有磷酸化p38MAPK的表达[2,3]。
1材料和方法
1.1标本的选取标本选取近1年我院耳鼻喉科住院和门诊行鼻内镜手术的复发性鼻息肉患者20例,所有患者均有两次以上鼻息肉手术史,术前均未接受过糖皮质激素治疗;初次鼻息肉患者20例,未进行过鼻腔鼻窦手术,亦未接受过糖皮质激素治疗;行鼻腔泪囊吻合术或鼻中隔矫正术,取正常鼻黏膜组织20例。要求所有患者经检查无变应性鼻炎、支气管哮喘、慢性支气管炎、阿司匹林耐受不良和其他系统严重疾患。并按1997海口标准进行临床分期分型。研究前1个月内未进行激素和抗组胺药物治疗。经手术取出组织,术后均经病理证实。
1.2主要试剂(1)p38MAPK兔抗人多克隆抗体:购自美国Cayman公司,工作浓度1:250。(2)免疫组化二抗试剂盒SP-9001(生物素标记羊抗兔IgG):购自北京中杉金桥生物试剂公司。(3)DAB染色试剂盒:购自北京中杉金桥生物试剂公司。(4)多聚赖氨酸:购自武汉博士德公司。(5)牛血清白蛋白(BSA):SIGMA公司产品。
1.3方法(1)石蜡组织块制作:手术切除的鼻息肉和下鼻甲粘膜组织立即切成1.5×1.5×1.5mm3的组织块,并快速投入10%甲醛溶液固定液中,固定12小时。酒精脱水、二甲苯透明后浸蜡,包埋,待石蜡全部凝固后,推出蜡块。(2)石蜡切片:修整蜡块,调整控制切片厚度约5µm,切成薄片后,须粘在玻璃片上,以记号笔在玻片上编号,放入温箱中烘干。(3)免疫组织化学检测p38MAPK在鼻组织中的表达:将切片脱蜡入水。(4)抗原微波修复。(5)血清封闭抗原Fc段受体:取出玻片勿洗,直接加非免疫血清(二抗同族),置于湿盒中,4℃,过夜。滴加一抗:倾去血清,勿洗,滴加一抗p38MAPK(1:250)50μl。阳性对照采用一肝癌组织标本同样滴加一抗。阴性对照采用一鼻息肉石蜡切片,一抗用PBS替代。标本置于湿盒中,4℃,过夜。次日,用PBS洗3min,重复3次。加入辣根过氧化物酶标记二抗IgG,37℃,10～15min。用PBS洗3min,重复3次。加入辣根过氧化物酶标记试剂,37℃,10～15min,再用PBS洗3min,重复3次。加入DAB显色液,室温显色5～10min,镜下控制反应时间,适时终止显色反应。单蒸水冲洗,苏木素复染几秒钟(稀释1:5,过滤),冲洗,切片脱水,透明,中性树胶封片。
光学显微镜下观察鼻组织中p38MAPK阳性表达情况。6个高倍视野光镜下观察照像,然后用JD109图像分析系统进行图像分析,测定阳性细胞数密度和灰度值。
Western blot方法检测磷酸化p38(p-p38)含量,各组分别切取50～100mg黏膜组织,尽量剪碎,按照北京普利莱公司胞浆胞核蛋白提取试剂盒的说明提取核蛋白。经蛋白定量,每条泳道加样15μL行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS 2PAGE)分离蛋白质,经电转印将蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上。牛血清蛋白室温封闭1h。加入稀释度为1:200的兔抗p-p38多克隆抗体,4℃孵育20h。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,稀释度为1:2000,室温下孵育2h,经TBS洗涤,DAB显色,分析各条带磷酸p38(p-p38MAPK)和β-actin的灰度值,并相除来进行标准化,作为p38的相对活化水平。
1.4统计学分析
统计学分析应用SPSS12.0软件分析系统,采用T检验分析组间显著性差异,以P<0.05为具有统计学意义。
2结果
2.1p38MAPK免疫组化染色结果
免疫组织化学染色结果显示,正常鼻黏膜组织中无或少量弱阳性染色;在鼻息肉组中可见大量p38MAPK的阳性染色,阳性染色呈棕黄色颗粒,主要集中在胞浆;在体外实验经布地奈德和克拉霉素及和p38MAPK特异性抑制剂SB203580处理后,鼻息肉组中仅可见p38MAPK呈弱阳性染色。
2.2p-p38及β-actin凝胶电泳结果(见图1)
为研究p38鼻息肉生成中的作用及机制,我们运用westernblot白印迹法定量技术比较了核p38蛋白(P-P38)在三种组织中的表达水平,结果示P-P38在鼻息肉组及对照组灰度的相对值分别为:0.767士0.77和0.355±0.087。二者相比有显著性差异(P<0.05)(见表1);经布地奈德和克拉霉素及和p38MAPK特异性抑制剂SB203580处理后,P-P38在鼻息肉组灰度的相对值分别为:0.582士0.69。(见图1)
表1 P-P38在鼻息肉和正常组织的表达(P-P38/β-action比值,x±s)
组别例数x±s
鼻息肉组 200.767±0.077
正常组150.355±0.087
图1 P-P38及β-actin凝胶电泳图
(A:为药物干预前,P-P38表达为阳性;B:为药物治疗后,P-P38表达呈弱阳性。)
3讨论
鼻息肉是一种常见病,发病率及复发率均较高,目前治疗最有效的方法为鼻内镜手术加糖皮质激素治疗,但是治疗后仍有20%左右复发,是鼻科目前治疗的难点。鼻息肉的发病机制尚未完全明确。目前认为鼻息肉主要是由多种细胞因子参与的一种持续性炎症反应。细胞因子是由机体的免疫细胞和非免疫细胞所合成和分泌,具有较强的生物活性,广泛存在于鼻息肉的微环境中。p38MAPK信号通路是新近阐明的参与炎症机制的信号通路之一,可能在鼻息肉中起至关重要的介导TNF-α与COX-2的信号传导作用。
p38蛋白是新近发现的与炎症、应激反应密切相关的蛋白激酶,激活后的p38即由胞浆进入到细胞核,表现为其活性形式磷酸化p38(p-p38),它是细胞内主要的信号转导系统[2]。p38MAPK(Mitogen-activated proteinkinase,MAPK)信号传导通路是新近阐明的一条MAPK通路,p38MAPK被激活后,引起下游相应的信号启动并产生广泛的病理生理效应,通过“级联”程序调控细胞因子和应激引起的细胞反应来快速实现信号传递,造成炎症反应“级联放大”[3]。许多研究表明,p38信号传导通路在炎性反应性疾病的发生和发展中具有调控作用。研究发现,在哮喘、慢性阻塞性肺病、变应性鼻炎及慢性鼻-鼻窦炎中,p38MAPK的活化与各种细胞因子、炎性介质的释放有关[4]。Boehme等研究证实,p38MAPK通路能够被促炎因子TNF-ɑ所激活,TNF-α可快速诱导嗜酸性粒细胞中的p38MAPK的磷酸化,并呈时间、剂量依赖关系。鼻息肉的黏膜病理生理学改变与哮喘、变应性鼻炎及慢性鼻-鼻窦炎同属于呼吸道黏膜炎症反应,且密切相关。据此推测,鼻息肉的发病机制中可能也存在经p38M
APK信号传导通路信号的干预和调控。目前相关文献中对p38MAPK信号传导通路在鼻息肉中的作用研究很少。有研究发现,p38MAPK在鼻息肉组织中的黏膜上皮、腺上皮和血管的周围出现异常表达,且核内有磷酸化p38MAPK的表达[2,3]。
本课题研究结果显示,p38MAPK在鼻息肉组织中高表达,而且在复发性鼻息肉组织中表达更显著。表明p38MAPK信号通路参与鼻息肉的发生发展
参考文献
[1] 米淑娜,李志明.鼻息肉相关致病因素研究的新进展[J].医学综述,2007,13(5):365-367.
[2] 亢丽芳,夏立军.p38在慢性鼻-鼻窦炎和鼻息肉中的表达及意义[J].山东大学耳鼻喉眼学报,2008,22(6):517-519.
[3] 王相成,李玲香.p38MAPK信号通路关键靶点基因及肿瘤坏死因子在鼻息肉组织中的表达与意义[J].中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志,2008,(3):161-165.
[4] 黄翠萍,张珍祥,徐永健.哮喘大鼠肺组织p38蛋白激酶表达的变化及地塞米松对其影响[J].中华微生物学和免疫学杂志,2003,23(5):334-334.