榄香烯乳对大肠癌HCT—116细胞侵袭及miR—155表达的影响
[摘要] 目的 观察榄香烯乳对人大肠癌细胞迁移、侵袭的影响，并探讨其可能机制。 方法 采用不同浓度的榄香烯乳处理人大肠癌HCT116细胞后，以划痕试验方法检测癌细胞迁移能力，以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力，采用荧光实时定量PCR方法检测癌细胞miR-155 mRNA水平。 结果 人大肠癌HCT116细胞经榄香烯乳处理后，迁移和侵袭力均明显下降，且呈剂量依赖性（P < 0.05）。榄香烯乳处理组miR-155 mRNA水平明显下调，且呈浓度依赖性。 结论 榄香烯乳可降低人大肠癌细胞侵袭能力，下调miR-155 mRNA表达是其重要机制之一。
[关键词] 大肠肿瘤；榄香烯乳；侵袭力；miR-155
[中图分类号] R735.3+4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）12（a）-0007-03
近年来，国内大肠癌发病率逐渐增高，寻找有效的治疗药物和治疗手段乃当务之急。榄香烯乳（elemene）是从中药温莪术提取的有效成分之一，临床应用已显示其具有较广泛的抗癌谱[1-5]。但是榄香烯乳调控癌细胞侵袭的分子机制尚不完全清楚。本课题组以大肠癌HCT-116细胞为模型，探讨了榄香烯乳对癌细胞迁移、侵袭的效应，并从micro RNA（miRNA）角度探讨其分子机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
榄香烯乳，购自华立金港制药有限公司；人大肠癌细胞系HCT-116，本院组织细胞生物库冻存；RNA提取试剂TriIzol购自美国Invitrogen公司；基底膜胶（Matrigel）购自BD公司；RPMI 1640、胎牛血清均购自Gibco公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及药物处理 人大肠癌HCT-116细胞置于含5%胎牛血清的RPMI-1640液中，在37°C CO2培养箱中常规培养。待细胞至对数生长期，采用不同浓度（10、20、40 μg/mL）的榄香烯乳处理，以RPMI-1640代替榄香烯乳处理细胞作为空白对照组，3复孔，备测。
1.2.2 癌细胞迁移检测 采用划痕法检测癌细胞迁移能力，具体步骤参照文献[6]方法进行。基本操作步骤如下：（1）先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔0.5～1.0 cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。（2）同样方法培养细胞至对数生长期，消化、计数，使用培养基配制成浓度为8×105个/mL的细胞悬液， 6孔细胞培养板中每孔加入1 mL细胞悬液，放入37℃，5%CO2培养箱中培养直至细胞铺满单层。（3）用100 μL枪头沿培养板底部呈“一”字形划痕；用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。（4）弃去培养基，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，用培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入1 000 μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组。（5）6孔细胞培养板置于37℃ 5%CO2培养箱中培养24 h，拍照。
1.2.3 细胞侵袭检测 该试验在Transwell板上进行，具体步骤参照文献[7-8]方法进行。倒置显微镜（×100）观察穿过膜的细胞数。每张膜中央部分和周围部分各随机取3个视野，计数每个视野内穿过聚碳酸酯膜微孔的细胞数。
1.2.4 miR-155 mRNA水平检测 采用荧光实时定量PCR检测。采用Trizol方法抽提细胞总RNA抽提，采用试剂盒逆转录为cDNA。miR-155 定量PCR上游引物：5′-CGCGCTTAATGCTAATCGTGA-3′；下游引物：5′- GTGCAGGGTCCGAGGT -3′，大小为62 bp。内参GAPDH上游引物：5- CATCTTCTTTTGCGTCGCCA -3′；下游引物：5′- TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC -3′，大小为115 bp。循环条件及计算方法参照文献[9]进行。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学处理，所得到的数据均以均数±标准差表示，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 榄香烯乳对大肠癌细胞迁移的影响
采用划痕法观察榄香烯乳对癌细胞迁移的影响。与对照组癌细胞（图1A）比较，榄香烯乳处理组癌细胞迁移速度较慢，迁移距离明显低于空白对照组（图1B），后者划痕两侧癌细胞已趋融合。
2.2 榄香烯乳对大肠癌细胞侵袭的影响
收集经榄香烯乳处理的HCT116细胞，采用Transwell检测癌细胞侵袭情况。对照组、不同浓度（10、20、40 μmol/L） 榄香烯乳处理组穿过滤膜的细胞分别为（43.8±1.7）、（31.6±1.6）、（18.5±1.5）和（8.8±1.2）个。统计学分析提示，细胞侵袭呈浓度依赖性减少（P < 0.05）。
2.3 榄香烯乳对大肠癌细胞miR-155 的影响
以榄香烯乳处理大肠癌HCT-116细胞后，采用荧光实时定量CR检测。结果发现，与对照组比较，榄香烯乳各处理组miR-155 mRNA水平明显下调，呈浓度依赖性（P < 0.05）。见图2。
3 讨论
迁移性是转移性癌细胞重要特征之一。在成体组织中大多数正常细胞不具有迁移性，而恶性肿瘤细胞一般具有十分活跃的迁移性。体外培养时，正常细胞具有迁移的接触抑制，因而呈单层生长；而癌细胞丧失了迁移的接触抑制，从而呈多层重叠生长。本研究发现，大肠癌HCT-116细胞具有较强的迁移性，而经榄香烯乳处理后，细胞迁移距离明显缩短。
恶性肿瘤的主要生物学特性是侵袭和转移，而这也是恶性肿瘤患者死亡的主要原因之一。肿瘤侵袭与转移过程非常复杂，尽管不同种类肿瘤侵袭、转移特性有所不同，但侵袭、转移过程中的关链步骤基本相同。恶性肿瘤的转移过程首先包括肿瘤细胞的分离脱落（即恶性肿瘤细胞从原发肿瘤病灶脱离），然后向周围组织侵袭，当肿瘤细胞从原发肿瘤分离脱落后，必须穿透原发肿瘤周围的宿主结缔组织才能进入循环系统，之后通过血液循环和淋巴循环游走到远处组织器官，形成继发性肿瘤。在此过程中，肿瘤细胞侵袭细胞外基质是重要的步骤。在本研究体外侵袭实验中，观察到人大肠癌HCT-116细胞具有较强的侵袭能力，经榄香烯乳处理后，癌细胞侵袭能力明显下降，且呈浓度依赖性（P < 0.05）。由此说明，榄香烯乳对大癌细胞侵袭具有明显的抑制作用。
MicroRNAs是一类短序列、非编码、具有调控功能的长为20～24 nt单链小分子RNA。大量证据表明，microRNAs的异常表达与多种人类癌症的发生密切相关[10]。MicroRNAs的发现和应用为恶性肿瘤的诊断和治疗提供了新的靶点。实验研究表明，miR-155过表达和多种上皮系统来源恶性肿瘤的发生及其恶性生物学表型密切相关。在许多实体瘤如乳腺癌、大肠癌等多种实体瘤组织或细胞中高表达[11-12]，但目前尚不清楚miR-155在大肠癌细胞侵袭中的可能作用。本研究以榄香烯乳处理大肠癌细胞后，以蛋白质印迹方法检测MK基因蛋白水平，结果显示，榄香烯乳各处理组miR-155水平明显下调，且呈浓度依赖性（P < 0.05）。因此，笔者推测榄香烯乳抑制大肠癌细胞迁移侵袭，可能与下调miR-155 mRNA有关。
本研究结果提示，榄香烯乳可明显降低大肠癌细胞侵袭能力，下调miR-155表达是其重要机制之一。
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（收稿日期：2012-10-18 本文编辑：陈 俊）