TRAIL,联合表阿霉素对人卵巢癌3AO细胞生长的抑制作用研究

【摘 要】目的：研究TRAIL 与表阿霉素联合应用对人卵巢癌3AO细胞的杀伤作用，探寻卵巢癌临床化疗的新方案。方法：将TRAIL 与表阿霉素单独及联合应用于体外培养的人卵巢癌3AO细胞， 采用MTT 法检测细胞毒性作用，并镜下观察凋亡细胞结构改变。结果：50ng/ mL的TRAIL 与5 μg/ mL 表阿霉素合用于3AO细胞24 h 时后，测细胞抑制率为82.44 % ，明显高于单用TRAIL （50 ng/ mL） 时的9.96 %及单用多柔比星（ 5 μg/ mL ） 时的18.98 % ， P < 0.01 。细胞形态学观察显示，合用比单用有更多的卵巢癌细胞凋亡。结论：TRAIL 与表阿霉素可协同、高效杀伤卵巢癌细胞，这种杀伤效应是通过促进肿瘤细胞的凋亡来实现的。

【关键词】TRAIL；表阿霉素；卵巢癌；化疗

【中图分类号】R737.31 【文献标识码】A

卵巢恶性肿瘤是常见的女性生殖器官恶性肿瘤，早期诊断困难，晚期治疗效果差，其死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤之首。尽管某些化疗药可杀伤卵巢癌细胞，但其对正常组织造成的极大毒副反应已成为临床化疗时难以克服的瓶颈。近年来有关细胞凋亡的研究已成为寻找新的化疗药物和提高化疗疗效的熱点。

TRAIL 因能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡而成为近年来研究的热点，但因很多肿瘤细胞对其不敏感而使其临床应用受到很大限制。Takenari 等[ 1 ]认为，化疗药物与TRAIL 联合应用可提高肿瘤细胞对TRAIL 的敏感性，是一种有极大发展前景的抗肿瘤方案。但迄今为止有关TRAIL 与表阿霉素联合应用的报道很少，为此，我们将TRAIL 与表阿霉素单独及联合应用于体外培养的卵巢癌细胞株，以探寻增强TRAIL 敏感性的用药方案，为TRAIL 在卵巢癌化疗中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人卵巢癌3AO细胞株购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所； RP- MI1640 干粉购自美国Gibco 公司； 胰蛋白酶、MTT及Rnase A 均购自华美生物工程公司；人重组可溶性TRAIL 购自上海广澜生物工程公司；酶标仪（Bio-Rad公司） ； LH50A 型倒置相差显微镜（OLYMPUS） ； 荧光显微镜（NIKON 公司） 。

1.2方法

1.2.1 细胞培养及给药方法 人卵巢癌3AO细胞株置于含10 %小牛血清的1640 培养液中，在37 ℃、5 % CO2 饱和湿度的培养箱中培养。待细胞进入对数生长期时，以5 ×105 mL - 1 浓度接种于培养板中，培养24h 待细胞贴壁后给药。单用TRAIL 组选用10 、50 、100 、1 000 ng/ mL 四种浓度；单用表阿霉素组选用1 、5 、10 、20μg/ mL 4 种浓度，联合应用组选用50 ng/ mL的TRAIL 与5μg/ mL 表阿霉素合用，同时设立PBS空白对照组。

1.2.2 MTT 法检测肿瘤细胞抑制率 将5 ×105mL - 1细胞接种于96 孔板，每孔200μL ， 贴壁后加入不同浓度药物或对照PBS 的细胞培养基，每孔100μL ，每种浓度平行4 孔，培养24 h 后，每孔加入20μL 新配制的5 mg/ mL 的MTT ， 37 ℃继续孵育4 h ， 弃上清加150μL DMSO 溶解， 混匀后在540 nm 波长测定吸光度。肿瘤细胞抑制率（ %） =1-实验组A值/对照组A 值×100 %

1.2.3 肿瘤细胞凋亡形态学观察 于倒置相差显微镜下直接观察肿瘤细胞形态，数目及贴壁情况。另取盖玻片置入六孔板内，种入3AO 细胞过夜，使约为50 %～80 %满时加药，待细胞凋亡后，固定10 min ，加入0.20mL染色液，染5 min 后，将盖玻片盖在滴有抗荧光淬灭封片液的载玻片上，荧光显微镜下照片。

1.2.4 统计学方法 实验数据以x ±s 表示，不同组之间的比较用单因素的方差分析，两组间的比较采用t 检验，应用SPSS 11.5 软件分析数据。

2 结果

2.1 三种给药方式下的肿瘤细胞抑制率变化

2.1.1 TRAIL 对人卵巢癌3AO细胞的抑制作用

人重组可溶性TRAIL 可抑制人卵巢癌3AO细胞增殖，并可见随药物浓度增加，对细胞杀伤作用也有缓慢提升。TRAIL 浓度为10 、50 、100 和1 000 ng/ mL时，细胞抑制率分别为（ 6.38 ±0.15 ） %、（ 9.96 ±0.40 ） %、（14.49 ±0.72） %和（52.59 ±1.92） %。经方差分析进行统计后表明，不同浓度间比较差异有统计学意义，P < 0.01 。

2.1.2表阿霉素对人卵巢癌3AO细胞的抑制作用

表阿霉素也可抑制人卵巢癌3AO细胞增殖，并具有浓度依赖性，表阿霉素浓度为1 、5 、10 、20μg/ mL 时，细胞抑制率分别为（ 5.77 ±0.35） %、（ 18.98 ±1.54） %、（49.79 ±2.69） %、（70.84 ±3.21） %。经方差分析进行统计后表明，不同浓度间比较差异有统计学意义，P < 0.01 。

2.1.3 低浓度TRAIL 与低浓度表阿霉素联用对人卵巢癌3AO细胞的抑制作用

50 ng/ mL 的TRAIL 与5μg/ mL表阿霉素合用于人卵巢癌3AO细胞24 h ， 采用MTT法测细胞抑制率为（ 82.44 ±3.61） % ，单用TRAIL（50 ng/ mL） 的抑制率为（ 9.96 ±0.40 ） %，单用表阿霉素（5μg/ mL） 的抑制率为（ 18.98 ±1.54） % ，将合用与单用分别进行t 检验的统计后表明，合用与单用比较差异有统计学意义， P < 0.01 。

2.2 人卵巢癌3AO 細胞凋亡的形态改变

相差显微镜下见单用TRAIL （50 ng/ mL） 及表阿霉素（5μg/ mL） 时仅部分细胞变小，变圆，偶尔可出现发泡现象；合用时可见染色质及细胞质浓缩，大量细胞脱落而悬浮于培养液中。荧光显微镜下见单用TRAIL （50 ng/ mL） 及表阿霉素（5μg/ mL） 时，荧光呈均匀分布，多为淡染的正常细胞。合用时可见细胞内浓集、发亮的荧光显色，表明有大量凋亡细胞存在。

3 讨论

TRAIL 即TNF 相关的凋亡诱导配体（ TNF related apoptosis inducing ligand） ， 是1995年由Wilely首先报道的可介导细胞凋亡的信号分子。它存在于人体的大多数器官和细胞，可以介导细胞的凋亡[2]。TRAIL具有特异的只针对肿瘤细胞杀灭作用而对正常组织无影响，TRAIL 仅诱导肿瘤细胞而不能诱导正常细胞凋亡，是其区别于常规化疗药的显著特征[3]。TRAIL特异性杀灭肿瘤细胞的这一特殊选择性被认为有可能利用TRAIL仅诱导肿瘤细胞和病毒感染细胞凋亡这一特点，发展新的治疗肿瘤的药物。

我们的研究发现，TRAIL 可抑制人卵巢癌3AO 细胞增殖，当使用量从低浓度的10 ng/ mL 上升100 倍后，其细胞抑制率增加还不到10倍，可见， 人卵巢癌3AO细胞对TRAIL 不是很敏感。表阿霉素是疗效确切的抗肿瘤药，其药理作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。我们证实表阿霉素可诱导3AO细胞细胞凋亡， 当表阿霉素浓度为1μg/ mL时，细胞抑制率约为5 % ，达到20μg/ mL 后，抑制率才达到72 % ，这种依赖增大剂量来提升药效的做法必将导致药物毒性及耐药性的产生[1]。值得注意的是，低浓度TRAIL （50 ng/ mL） 与低浓度表阿霉素（5μg/ mL） 联用可使3AO 细胞抑制率高达85 % ，与两药单用时的抑制率相比差异有统计学意义，这与Jazirehi 等[4]提出的TRAIL 与化疗药联合应用的凋亡放大理论相一致。TRAIL 对肿瘤细胞的选择性杀伤作用与其受体功能有关。目前，多认为诱骗受体不在肿瘤细胞而只在正常细胞中表达，因此，推测正常细胞是由于诱骗受体与死亡受体竞争性结合TRAIL 而使其免遭TRAIL 的杀伤作用。有学者认为，化疗药可以上调死亡受体的表达使肿瘤细胞对凋亡更加敏感[4]。目前，有关TRAIL 对肿瘤细胞的杀伤作用以及与化疗药联用增效的确切机制尚有很大争议。我们的研究只能证实， TRAIL 与表阿霉素合用对人卵巢癌3AO 细胞系药效肯定。实际上，不同肿瘤细胞对药物的敏感性有很大差别，即使是同种肿瘤细胞的不同细胞系对药物的敏感性也不尽相同，所以TRAIL 与表阿霉素合用于其他肿瘤细胞系的确切疗效尚需进一步研究。我们认为，两者联合作用产生增强效应的原因可能是：①表阿霉素能诱导卵巢癌细胞增强表达DR4、DR5 （death receptor死亡受体）。②某些化疗药物具有协同作用的机理可能是药物诱导线粒体细胞色素c的释放，细胞色素c进一步放大TRAIL诱导的Caspase阶梯反应 ；③某些化疗药物能增加TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性，并使抗TRAIL诱导的肿瘤细胞株变得对TRAIL诱导的凋亡敏感 。并且，体外实验不同于体内用药，后者由于受到机体内环境及体内药代动力学影响将更具复杂性。因此，将骨肉瘤细胞接种到裸鼠制成肿瘤动物模型后，再对TRAIL 的药理进行探讨是我们下一步的研究方向。本研究表明TRAIL能促卵巢癌SK3AO细胞凋亡，TRAIL与表阿霉素联合应用对细胞凋亡有协同作用，这可能与DDP增加促凋亡受体DR4、DR5的表达有关，为进一步研究TRAIL应用于卵巢癌的治疗提供基础。应用低毒剂量药物化疗可明显减轻化疗反应，结合TRAIL可以明显提高化疗敏感性，增强致凋亡率，有很好的临床应用前景。总之，我们有理由相信随着对TRAIL和化疗药物相互关系的研究深入，将对耐药的肿瘤细胞的治疗产生重要作用。

参考文献：

[1] Takenari Y， Kat suya S ， Kazushi S ， et al . Chemotherapy agent saugment TRAIL-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell lines[J] . Hepatology ，2000 ，32 （3） ：482 - 490.

[2] Wiley S R ， Schooley K， Smolak P J ， et al .Identification and characterization of new member of the TNF family that induces apoptosis [J] . Immunity ， 1995 ，3 （6） ：673 - 682.

[3] Pan G， Ni J ， Wei Y F ， et al . An antagonist decoy receptor and a deat h domain2containing receptor for TRAIL [J] . Science ，1997 ，277 （5327） ：815 - 818.

[4] Jazirehi A R ， Ng C P ， Gan X H ， et al . Adriamycin sensitizes the adrimycin-resistant 8336/ Dox40 human multiple myeloma cells to Apo-L/ tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-mediated （ TRAIL） apoptosis[J] . Clin Cancer Res ， 2001 ，7 （12） ：3874 - 3883.

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