HPV疫苗在预防宫颈癌领域的专利技术综述
【摘 要】宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，发病率位于女性肿瘤的第二位。预防HPV感染的最有效方式是使用HPV疫苗，特别是针对能引起宫颈癌的高危型HPV的疫苗。本文通过对HPV在预防宫颈癌的全球申请作为分析对象，并对该技术领域的技术发展进行介绍和总结。
【关键词】HPV;宫颈癌;疫苗
中图分类号： R737.33 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）17-0208-002
DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.17.098
1 人乳头瘤病毒与宫颈癌的基本概况
人乳头瘤病毒（Human Papilloma virus，HPV），亦称为人类乳突病毒，属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属，是嗜上皮性病毒。这种病毒具有高度的宿主特异性，仅感染人类。报道表明，全球一半以上的成人被HPV所感染。HPV病毒已分离出超过一百三十种，根据其致病性，可以分为高危型和低危型，高危型主要包括HPV16、18、33、31、45、58和52等，与宫颈癌的发病有关，低危型主要包括HPV6、11、42和44等，与生殖道疣状物有关。宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，发病率位于女性肿瘤的第二位，每年全球大约有50万例新发宫颈癌病例，近20万人死于宫颈癌。分子流行病学的研究已经证实HPV感染与宫颈癌有着十分密切的关系。HPV高危型（HPV16、18、31、45型等）的感染是导致宫颈癌发生的重要因素，宫颈癌中HPV DNA的检出率高达99%，其中约70%为HPV 16和HPV18型。预防与控制HPV感染的最有效方式是施用HPV疫苗，特别是针对能引起宫颈癌的高危型HPV的疫苗。2016年7月12日，国家食品药品监督管理总局批准葛兰素史克（GSK）公司的人乳头瘤病毒吸附二价（HPV16/18）疫苗Cervarix的进口注册申请;2017年11月9日，默克（默沙东）公司生产的四价（HPV6/11/16/18）疫苗Cardasil也获准上市;2018年4月28日，同样是默克公司生产的九价（HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58）疫苗Cardasil9获得上市许可[1]。本文旨在通过对HPV在预防宫颈癌的技术发展进行介绍和总结。
2 国内外专利申请概况
人乳头瘤病毒在预防宫颈癌方面的专利最早出现于1980s，并总体上呈现递增的趋势。2006年，宫颈癌疫苗获得美国FDA上市，受此鼓动申请量出现了明显的增加。该领域的申请量于2008-2010间出现大幅回落，2010年后再次显示出上升趋势。由图1中趋势可见，国内相关申请相比起步较晚，于2002年提出首个申请，但发展迅猛，总体趋势与全球趋势相符合，截止2017年国内申请的申请量已经接近全球申请的半数。由此可见，虽然中国宫颈癌疫苗相关领域起步迟于国外，但本国科研工作者高度重视本领域的研究和开发，中国的相关申请在全世界已经占得一席之地。同时，在华PCT申请数量也已超过半数，可见中国人口基数大，宫颈癌患者数量多的状况以及其背后的中国市场引起了国外申请人的高度重视。
如图2所示，人类乳头瘤病毒在宫颈癌防治方面的申请主要集中在中、美两国，两国总和占样本总量的71%。国内申请量明显超过美国以及其他发达国家，这说明近年来我国在人类乳头瘤病毒在宫颈癌防治领域有较大的进展，并已经积累了一定的技术实力。在占总样本量的57%的国外申请中，超过一半都有在华申请。这种状况可以在一定程度上说明，大部分申请人对于中国宫颈癌防治市场的巨大预期。结合目前商品化宫颈癌疫苗的事实现状，获得国家批准的本领域产品的知识产权都归于国外医药公司。
在本领域的研究较多集中于产品开发，这需要较大的资金和专业人员的投入，相比于个人和医院，公司企业和各大高校具有更为突出的优势。这种申请人结构是合理的，并可以保证本领域持续的申请量以及科研成果的产出。该技术领域的申请人分布相对较为分散，厦门大学在申请量方面较为领先，拥有15件专利申请;厦门万泰沧海生物技术有限公司和北京康乐卫士生物技术股份有限公司次之，分别拥有13和8件申请;其后是北京工业大学、广东拓谱康生物科技有限公司和艾托金生物医药（苏州）有限公司等。可见，该技术领域尚不存在某个或某几个申请人掌握具有绝大多数的申请量，不同申请人对于该领域的研究尚处于起步和探索阶段。与国内申请人分布较为类似地，国外申请人同样也具有分布多样化，申请相对分散的特点。默克公司以10件申请占据第一，葛兰素史克公司和宾夕法尼亚大学理事会则以7件申请位居第二，其后依次是贝勒研究所，阿德瓦希斯公司，国立大学法人东京大学等。可以看出，美国默克公司和英国葛兰素史克公司等生物医药巨头非常看重国内市场，中国长期作为其知识产权输出国，具有十分重要的地位。
3 专利主要技术领域发展
目前人类乳头瘤病毒在宫颈癌的防治方面的应用主要包括三个领域，基因克隆和蛋白纯化，疫苗构建以及病毒蛋白抗体。人类乳头瘤病毒具有诸多亚型，因此对不同亚型的所述基因进行克隆是构建宫颈癌疫苗的第一步，例如发明JPH0279980A，分离得到病毒16、18、31、33以及35型的52b基因;发明EP0523391A1，分离获得病毒16型的E6和E7的多肽。随着对病毒多肽序列的开发，准确诊断病毒感染同样是人类要解决的重要问题之一。因此，开发者将目光投向了如何准确检测病毒感染上，发明EP1656561A2公开了针对病毒L1和L2蛋白的单克隆抗体，可以迅速检测出人乳头瘤病毒的感染;无独有偶，EP1487878 A2针对另一类重要的病毒蛋白E7，合成了具有特异性的单克隆抗体，用以临床诊断。进一步，利用病毒蛋白的免疫原性诱导人体产生相应亚型的HPV抗体，以病毒蛋白为核心的组合物作为宫颈癌疫苗进行使用在该技术领域中最为普遍。例如，较早的发明CN1064892A公开了一种重组病毒疫苗，所述病毒包含16型和18型的E6或E7蛋白。但是由于单一的病毒蛋白往往存在稳定性差，抗原性弱等缺陷;并且随着研究者对病毒蛋白结构的研究和解析，在后续的申请中，申请人更多地开始将目光集中在天然免疫原的改进和稳定上。例如CN1976718A公开了一种多价免疫组合物，其包括来自病毒16型、18型以及至少另一种病毒亚型的VLP或病毒壳微体。所述组合物可以同时使人体对多种亚型的HPV产生免疫反应，进而预防所述病毒亚型的感染。申请人为了提升所述组合物的免疫原性和稳定性，还进一步添加了3D MPL和氢氧化铝。此外，EP2108657A1提供了一种含有病毒16型的E6蛋白的AP共有序列结构域（Cys-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Xaa）的宫颈癌疫苗;CN102458440A提供了一种由包括乳头状瘤病毒（PV）L1蛋白的嵌合多肽组装而成的病毒样颗粒（VLP）組合物，所述乳头状瘤病毒L1蛋白中插入了由来自乳头状瘤病毒L2蛋白的某一序列组成的表面展示肽，可见在该发明中，不仅同时利用病毒的L1和L2蛋白，还对L2蛋白进行了人工优化，并实验证明其可以明显提高所述组合物的免疫原性。虽然国内申请在该技术领域起步较晚，但并不意味着中国在该技术领域已经完全错过，相反，2007-2008年是宫颈癌疫苗相关申请的黄金时期，该技术领域各种发明百花齐放，百家争鸣。然而宫颈癌疫苗尚不完善，而国内申请人明确这一点，并在近年来一直致力于更有效更安全的疫苗开发。由北京工业大学的申请CN103740741A公开了一种重组腺病毒疫苗，其核心在于提供了一种HPV18型病毒的E6E7蛋白融合突变体序列。所述疫苗具有较好的安全性，并且对于HBV18的感染具有极其显著的预防作用。
病毒蛋白选择直接决定了疫苗的效率，早期蛋白E6、E7以及晚期蛋白L1、L2是疫苗免疫原选择的主要靶标，特别是早期蛋白E7，相比于变异率高的E6，其更为保守，并且其在病变组织中具有极高的表达，针对其结构和功能的研究众多，因此其往往成为疫苗首选的靶抗原[2]。与此同时，如上所述，近年来针对多种病毒蛋白的宫颈癌疫苗层出不穷，例如将E6、E7进行融合表达、将L1、L2进行串联表达或者将所述病毒蛋白进行不同形式的组合以提高免疫有效性也是该技术领域发展的主流趋势。
HPV16和18型这两个导致了70%宫颈癌发生的高危型病毒必然是研究和针对的重点。如中国食品药品监督总局批准上市的二价宫颈癌疫苗，即是针对这两种病毒亚型。排在第三位的是58型病毒，针对其的相关申请具有仅次于16、18型的申请量也是有其重要原因的。HPV58型同样是高危型人乳头瘤病毒，HPV58虽在全球范围内感染率不高（阳性率仅2%，位于第7位），但在亚洲和非洲却呈现出特殊的流行状况（阳性率高达6%-30%，最高位于第2位，仅次于HPV16）。中国内地是全球HPV58 高发区之一，1996-2007年多次报道宫颈癌患者中HPV58 阳性率仅次于HPV16，某些地区甚至高于HPV16 和HPV18，远高于同期国外文献报道的数字。在上海、江苏、四川、广东等地，高发态势尤为明显[3-4]。因此结合果然HPV感染的具体特点，针对58型病毒感染的预防也是国内申请人在该技术领域的一大研究重点。
4 国内申请人在宫颈癌疫苗领域的创新
国内申请人并非仅仅是在追逐欧美的脚步，而是独立自主，并有所突破。我们知道，很多宫颈癌疫苗仅能预防HPV的感染，但对于已经感染的人群效果很差甚至毫无效果，可防不可治的尴尬局面亟待解决。因此在已经开发出预防性疫苗的当下，一种以HPV蛋白为免疫原，具有殺伤HPV阳性的宫颈癌细胞，治疗宫颈癌的治疗性疫苗显示出巨大的市场需要。2015年，由广东拓谱康生物科技有限公司开发的携带人乳头瘤病毒16型多点突变型E7mm的重组腺相关病毒载体诞生（CN105177048 A）。这种重组腺病毒载体是通过将具有致瘤性的HPV-16的E7抗原基因多点突变为无致瘤性的E7抗原基因，再将该突变后基因插入已经剔除结构基因的腺相关病毒载体中而获得的。该重组腺相关病毒可将其携带的突变型HPV-16 E7mm抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。被该组腺相关病毒感染的DC所诱导的CTL在体外和患者体内均可有效地抑制HPV-16 E7阳性细胞的生长或者杀灭HPV-16 E7阳性的细胞，且无致瘤性。可见针对宫颈（下转第158页）（上接第209页）癌细胞几乎都未HPV阳性的特点，同样利用病毒蛋白，靶向免疫细胞对肿瘤细胞的杀灭，并且安全无二次致瘤的风险。
5 小结
结合HPV感染人群众多，且宫颈癌患者众多的现实情况，在不断完善预防性疫苗的同时，治疗性免疫药物相关会迎来新的一轮高潮。我国宫颈癌疫苗潜在市场空间将达到千亿级别，其在该技术领域的研发应该还会进一步持续。
【参考文献】
[1]“从默沙东九价HPV疫苗8天获批上市谈起”，ailsa，中国生物技术信息网，2018年5月7日.
[2]“人乳头瘤病毒E7蛋白的研究”，范雪莉等，微生物与感染，第28卷第1期，第8-11页，2005年10月20日.
[3]“人乳头瘤病毒58 型的系统地理学分析”，李燕云等，中国科学C辑：生命科学，第39卷第7期，第654-661页，2009年12月31日.
[4]“Worldwide genomic diversity of the high-risk human papillomavirus types 31， 35， 52，and 58， four close relatives of human papillomavirus type 16”，Calleja-Macias I E等，J Virol，第79卷第21期，第13630-13640页，2005年11月30日.
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