武夷水仙茶产地判别多元数字化指纹图谱构建

摘 要 武夷水仙是武夷岩茶最重要的生产茶树品种之一，传统上根据武夷山地区微域自然环境的不同将其产区分为“名岩”和“丹岩”。通过对2个产区武夷水仙茶品质组分和矿物质元素分析测定及差异显著性检验，运用多元数字化指纹图谱技术构建产地判别模型。结果显示：“名岩”和“丹岩”产区的武夷水仙茶叶中Ni、Ba和Mn存在极显著（p<0.01）差异；Cr、K和Cd存在显著（p<0.05）差异；茶多酚、咖啡因、粗纤维、氨基酸总量、茶黄素、茶红素、茶褐素、18种氨基酸组分、11种茶多酚组分、F、Fe、Ca、Mg、Al、P、Cu、Zn、Sn、Pb、Na、Mo、Co和As的差异不显著（p<0.05）。以Pearson卡方系数大于0.95为筛选依据，从57个试验变量中选择Mn、Ni、Cd、Ba和Cr这5个变量作为产地判别模型构建的特征变量，有效避免了模型的“过度拟合问题”，该判别模型的识别正确率达88.24%。该结果也说明矿物质元素指纹图谱适合于武夷水仙茶叶产地的判别研究。

关键词 多元数字化指纹图谱；武夷水仙茶；产地判别；判别式算法

中图分类号 TS272.5；S571.1 文献标识码 A

武夷岩茶是中国十大名茶之一，武夷水仙茶是武夷岩茶的一个重要种类，是以福建省武夷山特定生态环境下生长的武夷水仙茶树品种的鲜叶为原料，经武夷岩茶加工工艺制成，具有“岩韵”品质特征的乌龙茶。武夷水仙茶“香气浓郁，滋味醇厚”，在当地茶界素有“最醇不过水仙”的说法，是武夷岩茶的典型代表产品。武夷岩茶属于地理标志保护产品，其独特的“色、香、味、韵”等品质特征与其生长环境关系密切，2002版武夷岩茶国家标准GB18745曾对其地理范围的划分进行了进一步的明确，将武夷山风景区70 km2的范围划定为“名岩产区”，而除名岩产区外的武夷岩茶原产地范围定为“丹岩产区”。

指纹图谱是一种从整体概念出发，识别并研究复杂体系的技术手段。关于茶叶指纹图谱的研究国内外有诸多报道，其中应用最多的当属色谱技术[1-6]。其余的例如元素分析[7-8]、电子鼻和电子舌[9-11]、近红外光谱[12-13]等也有涉及。茶叶的品质构成极为复杂，其组分的构成情况会受到茶树品种、栽培条件、原料产地、加工工艺等诸多方面的影响，因此使用单一的指纹图谱进行研究，难以避免存在片面性。而近年来出现的多元数字化指纹图谱技术为解决上述问题提供了良好的方法思路，该技术是基于信息融合理论，将不同技术手段所获取的“指纹数据”进行串行或并行像素级信息融合后，提取有效关键变量，采用计量学方法进行相似度评价和模型构建。本研究采用该思路，综合常量理化分析方法、色谱分析方法和元素分析方法对“名岩”和“丹岩”产区出产的武夷水仙茶叶的品质组分差异性进行定量与对比（具体包括茶多酚、咖啡因、粗纤维、灰分、氨基酸总量、茶黄素、茶红素、茶褐素、茶多酚组分、氨基酸组分、主要的常量和微量矿物质元素），通过对所采集的多元图谱信息的合并与筛选，从57个指纹变量中筛选出5个最重要变量，完成数学判别模型的构建。上述方法大大简化了判别模型结构，有效避免了“过拟合问题”（是一种大数据建模过程中常见的问题，指模型在训练集中达到非常高的逼近精度，但对训练集以外的样本逼近精度急剧下降。出现该问题，说明模型的适应性有待提高），实现了武夷水仙茶产地的鉴别。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用武夷水仙茶样品由福建省武夷山香江茶叶公司、武夷山节节清茶叶公司、武夷山华辉九龙岩茶厂、武夷山钦品茶叶有限公司、武夷山市琪明茶叶科学研究所、武夷山岩上茶叶有限公司、武夷山袍中天茶行、武夷山永生茶厂、武夷山市幔亭岩茶研究所、武夷山沁袍茶行等单位共同提供，样本数量为34个，系采用2012年春季各企业自有茶园出产的鲜叶（其中名岩产区14个，丹岩产区20个），并经相应的武夷岩茶生产工艺加工制成。

1.2 方法

1.2.1 理化分析方法 茶叶水分测定参照GB 5009.3-2010食品中水分的测定，使用BINDER鼓风干燥箱（德国BINDER公司）；茶叶粗纤维测定参照GB/T 8310-2002茶粗纤维测定，使用FOSS TECATOR半自动粗纤维分析仪（瑞士FOSS公司）测定；茶叶灰分的测定参照GB/T 8306-2002 茶总灰分测定，使用SX2型箱式电阻炉（中国上海实验仪器厂有限公司）；茶黄素、茶红素和茶褐素测定方法参照黄意欢[14]，测试结果以干基计，使用UV-1750紫外可见分光光度计（苏州岛津有限公司）测定。

1.2.2 主要茶多酚组分及咖啡因分析方法 杨梅素及其糖苷、槲皮素及其糖苷含量的测定参照Wang等[15]方法，测试结果以干基计，所使用的槲皮素（纯度≥98%）和杨梅素（纯度≥98%）标准品由成都曼斯特生物科技有限公司提供。茶多酚、儿茶素及咖啡因含量分析方法参照 GB/T 8313-2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的测定；所使用的没食子酸（纯度≥98%）和咖啡因（纯度≥98%）标准品由成都曼斯特生物科技有限公司提供，儿茶素组分标准品（表没食子儿茶素、简单儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯）纯度均≥99%，由上海融禾医药科技发展有限公司提供。上述分析过程均采用Agilent 1200系列高效液相色谱（美国Agilent公司），配备脱气机，自动进样器，柱温箱及二极管阵列检测器，C18 Zorbax Ecllpse XDB-18反相色谱柱（规格：长250 mm，直径4.6 mm）完成。

1.2.3 游离氨基酸组分分析方法 称取0.5 g样品，加入80 mL纯净水，沸水浴45 min后，冷却定容至100 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，采用日立L8900自动氨基酸分析仪分析方法（锂盐系统）对样液进行分析，分离柱规格：长60 mm，直径4.6 mm，柱填料类型为#2622日立专利离子交换树脂；所使用的17种氨基酸混合标准品（苯丙氨酸、丙氨酸、茶氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、胱氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸）均由日立公司提供；茶氨酸标准品（纯度≥98%）由SIGMA公司提供。

1.2.4 矿物质元素Sn、Mo、As和Cd分析方法

在高压消解罐中称取0.5 g粉碎样品，并加入8 mL优级纯硝酸（德国默克公司），160 ℃下消解2 h，冷却后定容至50 mL，以X series 2电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS（美国Thermo Fisher公司）测定。仪器优化操作参数为：CCT模式，碰撞气为H2/He混合气体（其中H2所占比例为7.6%），碰撞气流速0.60 L/min；等离子体射频功率1 200 W；同心圆雾化器，带碰撞球锥形石英雾室；半导体制冷温度：4 ℃，冷却气流速13.0 L/min，辅助气流速0.80 L/min，雾化气流速0.80 L/min；采样锥直径1.0 mm，截取锥直径0.4 mm，采样深度9.3 mm；数据采集模式：跳峰测量，每峰3个通道，测量时间10 ms，扫描100次，重复3次，分辨率125；选择计数的同位素分别为：75As、95Mo、111Cd、118Sn。单一元素标准品溶液Sn、Mo、As和Cd，浓度均为1 000 μg/mL，由国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院提供。各元素的工作曲线线性范围及相关系数见表1所示。使用生物成分分析标准物质——绿茶GBW10052（GSB-30，由中国地球物理地球化学勘查研究所提供）对元素分析过程进行质量控制。

1.2.5 矿物质元素Zn、Cu、Ni、Co、Pb、Cr、Ba、P、Ca、Mg、Fe、Al、Mn和Si分析方法 在高压消解罐中称取0.5 g粉碎样品，并加入8 mL优级纯硝酸（德国默克公司），160 ℃下消解2 h，冷却后定容至50 mL，以OPTIMA 8000型电感耦合等离子体发射光谱仪ICP-OES（美国Perkin Elmer公司），测定。仪器优化后的工作参数为：射频功率1 250 W，冷却气流量14.5 L/min，雾化气流量0.80 L/min，辅助气流量0.20 L/min，样品观测高度11 mm，溶液提升量1.5 mL/min，轴向观测模式；等离子体气流量：15 L/min；辅助流量：0.20 L/min；雾化器气流量：0.55 L/min；射频功率：1 300 W；进样量：1.5 L/min；冷却气：99.999%液氩；载气：99.999%液氩。单一元素标准品溶液Zn、Cu、Ni、Co、Pb、Cr、Ba、P、Ca、Mg、Fe、Al、Mn和Si，浓度均为1 000 μg/mL，由国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院提供。各元素的工作曲线线性范围及相关系数如表2所示。使用生物成分分析标准物质——绿茶GBW10052（GSB-30，由中国地球物理地球化学勘查研究所提供）对元素分析过程进行质量控制。

1.2.6 矿物质元素F分析方法 参照GB/T 5009.18-2003 食品中氟的测定。以Dual Star pH/ISE氟离子测定仪（美国ThermoFisher公司）测定。氟标准溶液，浓度为1 000 μg/mL，由国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院提供。

1.3 数据分析

组分含量描述统计及差异显著性检验采用IBM SPSS Statistics 19.0软件完成；多元指纹图谱判别模型的构建采用Clementine12.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 理化组分差异性

武夷水仙茶名岩和丹岩产地的理化组分差异显著性检验结果见表3所示，直观上观察，名岩产地的茶多酚、氨基酸含量稍高于丹岩产地，而茶褐素含量则稍低；但上述各组分的差异均未达到显著性水平（p>0.05）。

2.2 茶多酚组分差异性

武夷水仙茶名岩和丹岩产地的茶多酚组分差异显著性检验结果见表4所示，其中游离态的杨梅素和槲皮素均未检出，直观上观察，名岩产地的表没食子儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯，表儿茶素，没食子儿茶素没食子酸酯均高于丹岩产地；而没食子酸，儿茶素，表儿茶素没食子酸酯，杨梅素苷和槲皮素苷则略低于丹岩产地；但上述各组分的差异均未达到显著性水平（p>0.05）。

2.3 氨基酸组分差异性

武夷水仙茶名岩和丹岩产地的氨基酸组分差异显著性检验结果见表5所示，直观上观察，名岩产地的茶氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和组氨酸含量均高于丹岩产地，而苯丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸则低于丹岩产地；从标准差的结果上看，名岩产地的丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸的含量与丹岩产地相比存在较大的差异。各组分的差异均未达到显著性水平（p>0.05），但值得注意的是苯丙氨酸，胱氨酸，亮氨酸和苏氨酸间的差异显著性水平已接近0.05的水平，表明名岩与丹岩产地出产的武夷水仙茶在上述4种氨基酸的含量水平上存在一定差异。

2.4 矿物质元素差异性

武夷水仙茶名岩和丹岩产地的矿物质元素差异显著性检验结果见表6所示，各元素从高至低依次为K、Ca、P、Mg、Mn、Al、Fe、F、Zn、Ba、Cu、Na、Ni、Cr、Pb、Co、Mo、As、Sn、Cd，直观上观察，名岩产地出产的武夷水仙茶除K元素含量低于丹岩产地外，其余矿物质元素的含量均高于丹岩产地；差异显著性检验结果显示，Cr，K，Cd的含量间存在显著性差异（p<0.05），而Ni，Ba，Mn的含量间存在极显著差异（p<0.01），其余元素的差异，均未达到显著性水平（p>0.05）。

2.5 多元指纹图谱产地判别模型的构建

应用Clementine12.0软件中的“特征选择”节点，对建模特征变量进行筛选，以Pearson卡方系数作为变量筛选的依据（Pearson卡方系数结果大于0.900的变量见表7所示，选择大于0.950的变量为建模变量），在分区节点中将样本集按照7 ∶ 3的比例划分为“训练集”与“测试集”，其中“训练集”用于模型构建，共引入Ni、Mn、Ba、Cr和Cd共5个变量，采用“判别式算法”建立判别模型，而后使用“测试集”数据对该模型判别效果进行测试。全过程数据流结构见图1所示。

2.6 多元指纹图谱产地判别模型判别结果分析

模型判别结果见表8所示，该模型对“训练集”的判别准确率为86.36%，在22个样品中存在3个误判；对“测试集”的判别准确率为91.67%，在12个样品中存在1个误判；对全部34个样本总体的判别准确率为88.24%，换而言之，上述5中元素能够解释2个产区茶叶差异性的88.24%。

表3～6的分析结果说明了2个产区出产武夷水仙茶叶的组分差异性，但却难以反映出差异性在产地判别过程中的重要性顺序，因此应用Clementine12.0软件，通过Pearson卡方系数的计算和识别模型的构建（操作过程见文2.5多元指纹图谱产地判别模型的构建），对判别变量的重要性进行排序。见表9所示，本判别模型共引入了5个元素，依次为Mn、Ni、Cd、Ba和Cr。其中Ni、Cd和Cr属于重金属元素，它们在样品中的含量均较低；而Mn、Ni、Ba、Cr也是人体必须的微量矿物质元素，同时对茶树的生理代谢过程也存在一定的作用。上述5种元素中，Mn元素的重要性系数最高，达0.356；其次为Ni，达0.191；其余元素Cd、Ba、Cr的重要性系数较为接近，均为0.15左右。

3 讨论与结论

与前人研究工作相比，本研究最突出的特点在于，基于已有的理论研究基础对指纹图谱的目标物质进行了范围划定，而后根据显著性检验结果提取特征变量后，再进行判别模型的构建。该思路的优势在于能够对判别2个产地差异性的机理进行明确的阐述，同时由于精简了分析变量，使得研究结果在实际鉴别工作中应用的实用性大大提高。而先前研究中常见的色谱指纹图谱[1-6]，其识别过程最大的不足是判别过程基于“灰箱理论”。即，分析过程通过对获得的包含大量未知组分的色谱峰进行数字化，并采用模式识别技术进行模型构建研究。该过程虽然可以针对研究目的，对数字化的指纹图谱进行特征提取和判别，但由于大量未定性组分的存在，因此实际上仍无法对形成差异性的具体机理进行阐述，后期只有通过对目标未知物的鉴别，才能明晰其机理。而由于未知物的鉴别工作需要耗费大量的资源，因此多数研究未对其继续深入。由于目标物质的无法确认，因此所获得的研究结果在实际鉴别工作中的应用较为有限。

另外，需要指出的是本研究在数学模型构建过程中所采取的思路为：通过特征筛选的方式，先将57个数字化指纹变量进行筛选，从中选取选择Pearson卡方系数大于0.950的变量进行建模。起初，在研究过程中曾尝试直接将57个变量不做筛选而直接输入，由所选择计量学算法根据变量在模型中的显著性检验结果，以步进方法选择特征变量，该思路所构建的模型判别准确率甚至可以高达95%以上，但存以下几个问题：第一，模型所使用的变量过多（引入10个以上变量），因此，模型的适应性较差，容易出现“过拟合问题”；第二，存在模型所引用的判别变量和判别规律，可能与现有理论规律相背离。由于可能存在的“无效变量”输入，使得模型的“噪声信息”增加，造成了模型其所使用的数学判别逻辑与客观实际相背离。因此，认为本研究现有的判别模型构建思路，通过“特征筛选”，对输入模型的变量进行了有效性筛选，不但可以简化模型，使判别过程符合客观实际，而且能够大大提高判别模型的适应性。

对名岩和丹岩产地理化组分、茶多酚组分、氨基酸组分和矿物质组分差异显著性检验显示，除矿物质元素组分存在差异外，其余组分并未发现显著性的差异（p>0.05）。故此认为，元素指纹图谱更适宜于作为产地鉴别的依据。该结论与茶叶产品自身的特点是相符的，茶叶产品的品质构成除受到其原料产地的栽培气候和土壤环境的影响外，还与其不同的加工工艺密切相关，例如：茶多酚组分和氨基酸组分的构成会受到加工过程中发酵程度的影响，而产生变化。唯有其矿物质元素构成受加工过程的影响相对较少；此外，武夷山是中国重要的自然保护区，且早在1988年就已经实行了严格的环境保护措施，关于武夷山岩茶产区土壤重金属污染的调查研究[16-17]也显示，该区域内的土壤未受到污染，故认为不同产区茶叶中上述5种元素差异性的主要来源应为土壤背景，或是由于特定的微域气候环境导致其在茶树鲜叶中不同程度的富集。

模型判别结果还显示，Mn是武夷水仙茶叶产地判别中的关键变量，该结果与元素差异性分析的结果相一致，即丹岩产区出产茶叶的Mn含量显著高于名岩产区。Mn是人体必需的微量元素，对生殖、神经传导、脂质代谢和自由基的清除有重要作用[18]。而茶树是天然的聚锰作物，其Mn的含量为一般作物的10倍以上，它在茶树中主要是作为酶的辅基起作用，参与氧化还原过程，对茶树的光合作用及维生素C的形成有一定影响[19]。有研究显示[20]，名岩和丹岩产区土壤中的Mn不存在显著性差异，而pH的差异却达极显著水平。茶树中Mn含量的高低与两方面的因素相关：其一，是土壤中活性锰含量的高低。其二，土壤的pH值会影响Mn的形态和溶解度，酸性土壤可以增加Mn的溶解度，使得酸性土壤条件下生长的茶树Mn含量较高。据此认为，丹岩产区出产茶叶的Mn含量显著高于名岩产区的原因，是丹岩产区土壤pH值相较于名岩产区更低，从而增加了土壤中Mn的溶解度，而使该产区生长的茶树体内富集了更多的Mn。因此，茶园土壤的pH值调控，可能对提高茶叶的品质有重要的作用。

此外，本研究所构建的判别模型的综合识别正确率达88.24%，已经属于高准确率水平的判别，该结果说明采用5种元素可以对88.24%的样品产地作出正确判别。通过增加“建模变量”便可以进一步地提高判别准确率，例如逐一将“胱氨酸”、“苯丙氨酸”等作为建模变量纳入判别模型。但该种方式的“判别准确率提升”是有一定限度的，需要以牺牲模型的“适用性”为代价。即，在提高准确率的同时会引起数学建模过程中常见的“过拟合问题”。因此，需要根据研究目的的需求在模型的“判别准确率”和“适应性”两方面进行平衡，从而调整判别模型的构建变量数量。

综上所述，本研究对武夷岩茶“名岩”和“丹岩”产区出产的武夷水仙茶叶中共计57个品质组分进行了分析对比，结果显示，其中Ni、Ba和Mn存在极显著差异，Cr、K和Cd存在显著性差异，其余组分（具体包括茶多酚、咖啡因、粗纤维、灰分、氨基酸总量、茶黄素、茶黄素、茶褐素、11种主要茶多酚组分、18种氨基酸组分、矿物质元素F、Fe、Ca、Mg、Al、P、Cu、Zn、Sn、Pb、Na、Mo、Co、As）未发现显著性差异（p>0.05）。应用多元数字化指纹图谱技术，对产地判别方法进行了研究；通过Clementine12.0数据处理软件中的“特征筛选”节点，从57个变量中筛选出了Mn、Ni、Cd、Ba和Cr作为判别模型的构建变量，并通过“判别式算法”成功构建了产地判别模型，模型测试结果显示，其识别正确率达88.24%。

致 谢 特别感谢福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心研究员蔡春平和高级工程师吴文晞对分析测试工作的支持；感谢福建农林大学园艺学院茶学专业硕士研究生何丽梅、叶小辉对实验过程给予的支持；感谢武夷学院教师林燕萍、卢莉、王飞权、王芳、冯花和黄毅彪对茶叶样品搜集工作给予的协助；样品部分理化数据测试工作获得了国家加工食品质量监督检验（福州）中心的协助。

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责任编辑：赵军明

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