地中海贫血实验诊断的研究进展
【摘要】地中海贫血(thalassaemias)是人类常见的特异性隐性遗传病。该病为单基因溶血性贫血症，在我国常见于南方人群，具有发病率高、重症患者胎儿死亡率高等特点，目前尚无彻底根治的方案。筛选恰当的地中海贫血实验诊断方法对该病的预防具有重要意义。本文综述了地中海贫血的实验室诊断方法，综合阐述了将筛查法和基因诊断法有机结合后统一应用，可以为地中海贫血的实验室诊断方面做出相应的贡献。随着现代社会科学技术的日益更新，地中海贫血的多种实验室诊断检测方法层出不穷。
【关键词】地中海贫血；实验室诊断；研究进展
Laboratory diagnosis of thalassemia Progress HUANG Lian-fen.The Second Peoples Hospital of Beihai City，Beihai 536000，China
【Abstract】Mediterranean anemia(Thalassaemias)the specificity of the human common recessive genetic disease.Single gene disease hemolytic anemia, common in southern populations in China,with a high incidence of severe fetal mortality in patients with advanced features,the program is currently no complete cure. Appropriate screening method for laboratory diagnosis of thalassemia prevention of the disease is important.This paper reviews the laboratory diagnosis of thalassemia,described the comprehensive screening method and combination of genetic diagnosis after the reunification of the application for the laboratory diagnosis of thalassemia and make the appropriate contributions.With the growing science and technology of modern society updates,thalassemia endless variety of laboratory diagnostic tests.
【Key words】Thalassemia；Laboratory diagnosis；Research
地中海贫血(thalassaemias)在人类遗传病中较为常见，它指的是因珠蛋白合成肽链时受阻而引发的特异性隐性遗传病［1］。该病为单基因溶血性贫血症，但其并不引起血红蛋白构造的变异，其具有多种亚型，以α、β两种亚型最为多见。α-地中海贫血与α-珠蛋白肽链合成被抑制密切相关。临床症状轻者仅表现出细微的血液学变化，重者则可能导致胎死腹中或早产后死亡。β-地中海贫血是因β-珠蛋白合成时基因发生突变，最终导致球蛋白合成减少而发病［2］。地中海贫血在东南亚、地中海等地区多见［3］，在我国则常见于南方人群。地中海贫血发病率高、重症患者胎儿死亡率高，但目前仍无彻底根治的方案。筛选恰当的地中海贫血实验诊断方法对该病的预防具有重要意义。现阶段用于地中海贫血症的实验室诊断技术主要存在筛查法和基因诊断法两大类，本文将此两类诊断方法综述如下。
1地中海贫血的筛查方法
随着医疗技术和医学水平的快速发展，地中海贫血的治疗已经有了较大的进步，但重症地中海贫血的治愈仍存在极高的难度。筛查法是地中海贫血实验诊断的常用方法，加强孕妇产前筛查和诊断对于重症地中海贫血的预防和根治具有重要指导意义［4］。系统的筛查法可以有效预防地中海贫血症的发生［5］，具有操作简便、手术经济负担小等优点［6］，常见的筛查手段主要包括：血液学常规检查和血红蛋白检查分析两大类，具体检查项目为。
1.1血细胞计数血细胞计数仪的使用是地中海贫血筛查法的必经步骤。血细胞计数仪可测定红细胞数(RBC)、白细胞数(WBC)和血小板基本参数。红细胞体积小和色素含量低是地中海贫血的主要临床症状之一［7］，所以红细胞的平均体积(MCV)和红细胞内血红蛋白的平均含量(MCH)对地中海贫血的筛查具有重要意义。目前MCV小于79 fl、MCH低于27 pg常被作为地中海贫血诊断的可疑筛查标准，在此情况下血红素、血细胞压积、红细胞数和白细胞数均会有一定程度的变化［8］。
1.2红细胞渗透脆性试验红细胞渗透脆性试验是用于检测不同渗透压浓度的低渗盐水溶液中红细胞的抵抗力［9］。红细胞渗透脆性试验记录红细胞从开始溶血到全部溶血后的界限，这个界限是由红细胞的表面积与体积的比值而决定的。在低渗盐的水溶液中，渗透脆性低的红细胞易发生膨胀破裂现象，所以通过测定渗透脆性可以明显表征红细胞的形态异常情况。地中海贫血症的患者常存在不同程度的红细胞变形，渗透脆性减弱。已有学者利用患者红细胞渗透脆性实验结果来判断地中海贫血症。
1.3血红蛋白分析对地中海贫血患者血液中的各种血红蛋白进行定性和定量分析是一种快速可靠的确诊地中海贫血的方法。血红蛋白分析的方法有：(1)血红蛋白电泳法：该法的理论依据为各种血红蛋白的等点电均低于7，在pH 8.5的缓冲盐溶液中带负电荷。若有电场存在时，各种血红蛋白会在电场作用下向阳极移动。因各种血红蛋白的等电点各不相同，其向阳极移动的速度也不一样。所以通过血红蛋白电泳法可对各种血红蛋白行定性分析。血红蛋白电泳法使用醋酸纤维薄膜作为支持物时，还能定量分析经电泳分离的血红蛋白［10］。(2)毛细管电泳法：该法中各种血红蛋白将毛细管作为分离管道，在电场作用下因其定向移动速度的差别而实现分离。该法具有简便快速、重现性高、灵敏度强、分辨率好和消耗样品或试剂量少等优点，已逐步被临床采用［11］。(3)Hb琼脂糖电泳定量法：该法的检测依据为碱变性检测，即碱性条件下不同Hb分子会在电场作用下分离，经染色等操作后即可对Hb琼脂糖进行定量。地中海贫血症患者检测绝对值会较正常患者升高。(4)检测不稳定型的血红蛋白：包含异丙醇、包涵体和热变性试验。不稳定型血红蛋白含量的检测对地中海贫血的实验室诊断具有重要作用，地中海贫血症患者检测结果会偏高。(5)免疫细胞直接化学检测法：采用荧光标记等方法特异性检验抗体，行产前微创伤筛查。(6)其他：如高效液相色谱法等均能用于血红蛋白的定量分析。
1.4红细胞形态学检查在已制备好的新鲜染色血涂片上行瑞氏染色，以镜检法观察红细胞体积和形态的变化。红细胞形态的变化可作为地中海贫血的初步判断依据，大小形态延长或大小不一的红细胞则可能考虑为地中海贫血患者。
1.5辅助检查测定血清中铁含量，排除缺铁性贫血患者；辅助X线检测胎儿骨骼形态、骨髓腔的变化等。
2基因诊断法
地中海贫血的发病和珠蛋白合成受阻断有关，该并大多数患者均是由于珠蛋白合成缺失而导致。随着现代医疗水平的高速进步，人类遗传病的治疗和诊断得到了极大发展。地中海贫血症的发生目前除被认为与DNA构造相关外，还被认为与基因转录、翻译过程密切关联［12］，所以应用以DNA为水平的基因检测可以更好的预防和诊断地中海贫血症。基因诊断中的探测物为患者某一特定基因，探测内容至少应包括DNA与mRNA［13］。目前，地中海贫血症的基因诊断已经被应用于临床，也将逐步发展成为一项实用的应用技术。本研究将应用于我国地中海贫血症实验室诊断的基因诊断法总结如下。
2.1聚合酶链反应(PCR)通过筛查法中的血红蛋白电泳检测可进行地中海贫血症的初步诊断，但仍存在某些地中海贫血不能达到有效诊断的问题。PCR利用DNA的聚合酶经体外作用于成对引物，催化两者间特异的DNA片段，促使基因合成，实现体外扩增技术。应用PCR为诊断方法具有操作简便、准确率高、检测速度快，适合临床广泛应用。针对两对以上特异性等位基因对的引物，还可应用多重PCR诊断。多重PCR诊断根据每组基因对突变位点的特异性扩增确定诊断结果，适合于因各种基因缺失而引发的地中海贫血。
2.2PCR结合斑点杂交法PCR结合斑点杂交法首次被应用于β-地中海贫血症的诊断和分型，结果证明该法结果可靠、准确性高，且检测时所耗样品量少、经济方便。但以该法行地中海贫血的实验室诊断时，应注意逐一仔细筛查待测基因，直至确诊某种突变，所以使用该法耗时长，且必须具备以下条件：(1)以已知突变基因为模版，应用PCR法分别扩展合成正常序列和突变序列的基因片段，将突变基因置于中心位置，并标记为探针；(2)挑选适合引物；(3)严格掌控杂交条件，保证探针和待测碱基间无配错情况，避免杂交失败。
2.3DNA点杂交检测法以DNA为靶分子进行DNA和DNA之间的杂交。杂交后以电泳法分离待测基因片段，将其转印并与某固相支持物结合，最后应用已标记的DNA探针检测。该法是最早应用于地中海贫血的实验室诊断方法，但诊断效率较低。20世纪80年代末期，有学者提出了反向杂交技术法诊断地中海贫血症。应用反向杂交法可明显提高诊断效率。经改良后的反向点杂交技术能针对多种类型的地中海贫血中的已知突变探针对，运用末端转移酶使其形成多聚尾巴，最后固定于指定膜上进行靶序列的扩增杂交。反向杂交技术的应用可以在一次杂交的基础上获得待测样本中多种突变序列的筛查结果，大大缩短了检测时间，提高了诊断效率。反向杂交技术经二次杂交后还能正确判断地中海贫血的类型，确定突变类型不同的纯合子、杂合子和等位基因对等，是见年来我国应用较多的地中海贫血实验室诊断方法。
2.4寡核苷酸探针(ASO)检测法等位基因特异性ASO探针检测技术为突变类型已知的地中海贫血实验室诊断法中最具代表性的方法之一。ASO探针技术能快速直接地找到患者所缺失的基因序列，准确判定地中海贫血的类型，具有高灵敏度、简单易行、特异性高等优点。但该法检测时仅针对某种或某类基因突变，需多次重复探测才能对待测样品进行准确评估。我国已有学者将ASO探针法应用于中国地中海贫血患者的实验室诊断，结果表明该法能够诊断出18种常见的突变探针，可以成功检测中国人口的地中海贫血症。也有学者证明该法除具有高的诊断准确率外，还能对大样本进行筛查和基因定型，能为地中海贫血的产前筛查提供新的检测手段。
2.5等位基因特异性扩增技术(ARMS)该法具有特异性，是针对某种突变类型的地中海贫血症而进行的针对性检测。该法针对特定的突变类型筛选特异性的碱基引物，通过扩增后的电泳分离结果断定有无相应点的突变。该法特别适合于小片段DNA的电泳分析，可以用于痕量检测，具有结果清晰、准确可靠等优点。
2.6限制性片段长度多态性连锁分析法(RFLP)该法是间接性的测试方法，是早期经常应用的地中海贫血实验室诊断方法。限制性片段长度多态性常表现在群体中，多是由于突变后限制性内切酶的作用位点改变或消失而导致对应DNA酶切片段发生变化。通过增加引物序列扩增产物中的酶切位点，并应用相对应的限制性内切酶水解正常和突变后的扩增产物，能应用电泳分离法而实现地中海贫血基因的检测。该法检测能反映出不同长度限制性片段中各种基因型的差异，但仍存在诊断局限性和操作繁琐性。
2.7基因芯片杂交法随着医学工作者对地中海贫血症的深入了解，基因突变类型的检测有了多种检测方法［14］。基因芯片杂交技术具有简单快速、痕量分析、自动准确、高效方便等众多优势，已成为地中海贫血基因诊断的重要新方法。基因芯片杂交法诊断地中海贫血是以核苷酸扩增为基础，应用荧光标记法或引物延伸法检测突变基因。该法以荧光的不同位点和颜色深浅变化为判断地中海贫血基因突变的类型，比传统方法具有更高的灵敏性和特异性，检测结果也更具准确性。基因芯片技术还因基因芯片具有较高的通量，能将多个地中海贫血待测基因集中于一张芯片上完成筛查，特别适合于人口中地中海贫血的大面积普查。但基因芯片造价高、成本昂贵，较难普及于临床检验。
综上所述，将筛查法和基因诊断法有机结合后统一应用，可以为地中海贫血的实验室诊断方面做出相应的贡献。地中海贫血的实验室诊断总的标准为简单方便、快捷高效、成本便宜，能够保证提高地中海贫血实验室诊断的准确性，避免误诊和漏查现象［15～17］。随着现代社会科学技术的日益更新，地中海贫血的多种实验室诊断检测方法层出不穷。
参考文献
［1］李霞，杨林，杨承东，等.地中海贫血的筛查与产前诊断.中国优生与遗传杂志，2008,16(2)：43-78.
［2］刘元力，胡朝晖，曾征宇，等.β-地中海贫血一个特殊基因突变的家系分析.中国医药导报，2008,5(5)：25-26.
［3］Hu H,Ii C,Xiong Q,et al.Prenatal diagnosis of beta-thalassemia by chip-based capillary electrophoresis.Prenat Diagn,2008,13(4)：123.
［4］Baig SM.Molecular diagnosis of beta-thalassemia by multiplex ARMS-PCR：a cost effective method for developing countries like Pakistan.Prenat Diagn,2007,27(6)：580.
［5］Traeger-synodinos J.Real-time PCR for prenatal and preimplantation genetic diagnosis of monogenic diseases.Mol Aspects Med,2006,27(2)：176.
［6］Zeren F.Preliminary Data on Preimplantation Genetic Diagnosis for Hemog 1obinopathies in Turkey.Hemoglobin,2007,3l(2)：273.
［7］何雅军，杨小华，马福广，等.红细胞平均体积和脆性及血红蛋白电泳联合检测在地中海贫血诊断中的价值.中华检验医学杂志，2005,28(3)：244.
［8］张新华，周艳洁，罗瑞贵，等.南宁育龄人群β-地中海贫血筛查及血红蛋白A2截断值的确定.中华检验医学杂志，2007,30(1)：53.
［9］Ii Y,Di Naro E,Vitucci A,et al.Detection of paternally inherited fetal point mutations for β-thalassemia using size-fractionated cell-free DNA in matema1 plasma.Am Med Assoc,2005,93(7)：843.
［10］Keikhaei B,Rahim F,Zandian KH,et al.Comparison of different indices for better differential diagnosis of iron deficiency anemia from thalassemia trait.Blood,2007,4(2)：95.
［11］Najmabadi H,Ghamar A,sahebjam F,et al.Fourteen-year experience of prenata1 diagnosis of thalassemia in iran.Community Genet,2006,9(2)：93.
［12］李军，殷和.地中海贫血的诊断技术及进展.重庆医学，2009,38(7)：864-865.
［13］李霞，徐剑锋，杨林，等.产前检查中实施地中海贫血筛查的临床意义.中国优生与遗传杂志，2005,13(3)：62.
［14］陈和平，陈冬，周沫，等.脐血常规血液检查和HBA定量在诊断新生儿地中海贫血的实验研究与应用.中国实验诊断学，2004,8(4)：366-368.
［15］邓捷，刘新志，刘颖琳,等.应用平均红细胞体积测定法及红细胞脆性管定量法筛查地中海贫血.中华妇产科杂志，2000,35(10)：610-612.
［16］陆小婵，卢冬，罗斌，等.联合检测对地中海贫血实验诊断的应用价值.检验医学，2007,22(1)：60-63.
［17］陈和平，陈冬，梁玲，等.孪生新生儿的地中海贫血实验分析.中国优生与遗传杂志，2006,14(9)：85-88.
【收稿日期】2011-04-27
(本文编辑：郎威)