聚合酶链式反应联合反向斑点杂交法对于β—地中海贫血的筛查价值
摘要：目的 对β-地中海贫血（β thalassemia，β-TM）患者的进行基因分析，了解β-TM患者的基因突变类型。方法 通过全血细胞分析，筛查出MCV﹤80fL，MCH﹤27pg，Hb﹤110g/L的贫血患者，然后进行血红蛋白电泳分析，通过诊断标准：MCV﹤80fL， HbA2>3.2%，HbF>3.1% 为阳性患者219例，进一步应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）结合反向斑点杂交技术（reverrsedotblot， RDB），检测其基因突变类型。结果 进行基因检测的219例患者中，男性127例，女性92例，进行PCR-RDB法的基因诊断共检出5种突变基因： CD41-42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（C-T）、TATAbos-28（A-G） 、CD17（A-T）、CD14-15（+G）。其中以CD41-42（-TTCT）突变类型占首位，IVS-Ⅱ-654（C-T）突变类型次之。结论 PCR-RDB法的基因诊断相对敏感度， 特异性高以及诊断的阳性率高。
关键词：β-地中海贫血，聚合酶链式反应结合反向斑点杂交技术，基因突变型
β-地中海贫血（β thalassemia，β-TM）也被称作β-珠蛋白生成障碍性贫血，是世界上最常见的单基因遗传性疾病，在我国的南方城市：云南、四川、广西、贵州等省份多见[1]。它是珠蛋白生成障碍性贫血中发病率最高的类型，是因为遗传基因缺陷导致血红蛋白中至少一种珠蛋白合成缺乏或者不足，引起的贫血或者病理状态。了解携带者的基因突变型对其婚后生育的指导有重要意义。
1 资料与方法
1.1一般资料 所有的标本均来自于2012年4月～2014年4月来我院并且疑为β-TM的患者，均是在全血细胞分析筛查MCV﹤80fL，MCH﹤27pg，Hb﹤110g/L的贫血患者；进行血红蛋白电泳，筛查符合条件[2]：MCV﹤80fL，MCH﹤27pg，Hb﹤110g/L的219例患者，其中男性患者：127例，女性患者：92例。年龄为1～60岁。标本均采集于血常规的试管中。
1.2方法 PCR-RDB法：主要包括DNA的提取、PCR反应和斑点杂交几个步骤：反应体系设定为：25μL，在PCR中设置的参数是：95℃，10min； 94℃，1min；55℃，30sec；72℃，30sec；35个循环。杂交时将模条与PCR产物（25μL）放入杂交管中，然后加入杂交试剂盒的A液6mL，沸水浴中加热10min，42℃杂交2h；将膜移至预热的B液中，42℃下洗膜15 min，将膜条浸泡在显色液当中，最后避光条件下显色15min，观察结果。
判定结果主要是依据如下原则：如果是在突变检测探针处出现斑点，而在相应的野生型探针处并未出现蓝色斑点，那么该位点为突变的纯合子；如果突变检测探针处出现显色的强度和相应的野生型探针相近的蓝色斑点，则该位点是野生型和突变型的杂合子；如果仅仅是在野生型探针处出现蓝色斑点，那么待检样品就没有上述的17种突变。检测的17种突变以及DNA探针在膜条上面的排位参见表1。
1.3主要的仪器和试剂 PCR分析仪（7500 Fast real-time，美国罗氏公司）； PCR应用亚能公司的试剂盒。
1.4数据分析 采用Excel2007软件对检出的阳性例数、构成比资料进行整理和统计。
2 结果
β-TM 纯合子和双重杂合子一般呈中间型/重型TM。本研究共检出β-TM 纯合子126例，双重纯合子9例，杂合子63例，双重杂杂合子20例，PCR-RDB法的基因诊断219例患者中，男性127例，女性92例，共检出5种突变基因型： CD41-42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（C-T）、TATAbos-28（A-G） 、CD17（A-T）、CD14-15（+G）。其中以CD41-42（-TTCT）突变类型占首位，为27.85%；IVS-Ⅱ-654（C-T）突变类型次之，为19.63%；重度贫血患者主要是新生儿和儿童，一般青春期前致死。轻微贫血者主要表现为未婚成年患者，另一部分为新生儿，还未表现出严重的贫血，或合并其他类型的TM 有关。这表明应加强本地区育龄人群β-TM 的筛查，有必要在新生儿、贫血患儿中进行β-TM 筛查，做到早诊断、早治疗，提高生活质量；同时对于成人婚前检查应该加强该项目，对婚后的优生优育进行有力的指导。见表2。
3 讨论
地中海贫血（thalassemia，TM），也叫做地贫，是一组遗传性疾病。它的发病机制是合成血红蛋白的珠蛋白链减少或缺失导致血红蛋白结构异常，这样的含有异常血红蛋白的红细胞变形性降低，会使红细胞提前被肝脾等破坏，致使红细胞寿命缩短，导致患者发生溶血性贫血。一般情况下，TM主要有α、β、γ和δ四种类型。其中的α和β是比较常见的类型。其中的β-TM是人类11号染色体上控制的β珠蛋白链合成的基因突变，然后β珠蛋白链合成受到抑制，引起β链合成减少或缺少造成α、β链合成的不平衡。α链、β链相似的γ链或δ链代偿性增生聚合形成HbF和HbA2，使 HbF和HbA2增加[3]，其它多余游离的α链会沉淀在红细胞内，导致红细胞变形，红细胞脆性降低，寿命缩短，从而发生溶血性贫血的遗传性疾病。全血细胞分析时，表现出：MCV﹤80fL，MCH﹤27pg，Hb﹤110g/L的小细胞低色素性贫血，中央浅染区扩大，红细胞大小不等，出现靶形、异形、嗜多色性红细胞、碎片红细胞、点彩红细胞、有核红细胞、豪-焦式小体等等；网织红细胞正常或者增高。如果夫妻双发为同型地中海贫血，由于该疾病为常染色体上的隐形遗传，那么该子女有1/4的机会患重型地中海贫血，这样的情况下，患者一般在青春期前死亡。将经过全血细胞分析筛查出的患者进行血红蛋白电泳。血红蛋白电泳是通过和正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可以发现异常血红蛋白区带。比如HbE、HbBarts、HbS、HbD、HbH、 HbF、HbA2和HbC，在珠蛋白生成障碍性贫血的血红蛋白电泳中，可以通过蛋白的含量来进行分类，诊断β-TM的标准：MCV﹤80fL， HbA2>3.2%，HbF>3.1%。此方法简便易行、快速可靠，电泳分析是血红蛋白电泳分离和鉴定最为常用和最为有效的方法[4]。将通过筛查标准的219例患者进行PCR-RDB基因诊断。
PCR-RDB是一种斑点杂交技术，优点是在一次的杂交反应中，可以同时检测样品中的几种核酸。PCR-RDB是基因诊断，也是分子诊断，是通过受检者的某一特定基因（DNA）或者是转录的产物（mRNA）进行分析来对遗传病进行诊断技术。该方法快速，简便，高敏感性和特异性强。在基因分型、基因突变检测方面具有独特和有利的优势[5]。基因检测，进一步完善提高了实验室对β-TM检测手段的准确性和灵敏度。，在世界范围已经发现了170多种β-TM基因突变，其中20多种为大片段缺失型，其他的都是点突变和少数的碱基缺失或者插入[6]。在我国已经发现27种基因突变型[7]。在本研究中17种突变位点检出了5种突变基因： CD41-42（-TTCT）、CD17（A-T）、IVS-Ⅱ-654（C-T）、TATAbos-28（A-G）、CD14-15（+G）。在纯合子中以CD41-42（-TTCT）突变类型占首位，构成比27.85%；IVS-Ⅱ-654（C-T）突变类型次之，构成比19.63%。
综上所述：在β-TM患者是社会和家庭的重大负担，诊断中充分应用PCR-RDB法是目前诊断患者和杜绝重型地中海贫血患儿出生行之有效的试验方法。加强该项目婚前检查的力度以及大力宣传相关知识是一个重要而艰巨的任务。
参考文献：
[1]李东明，玉晋武，韦媛，等.南宁地区14096例儿童地中海贫血筛查与基因诊断分析[J].中国小儿血液与肿瘤杂志，2013，18（6）：259-263.
[2]张之南，沈悌，主编.血液病诊断及疗效标准[M].第3版.北京：科学出版社，2007：29-35.
[3]陈智，杨侃，李慧，等.桂林市婚检人群β-地中海贫血筛查结果分析[J].广西医学， 2005，27（9）：1436.
[4]宋坚清，阎佩珩，孙淑艳，等. 电泳技术临床应用[M]. 沈阳：辽宁科学技术出版社，2006：5-6.
[5]Phylipsen M，Vogelaar IP，Schaap RA，et al.A new A0- thalassemia deletion found in a Dutch family（-AW）[J].Blood Cells Mol Dis，2010，45（2）∶133 -135.
[6]Alice E，Gallienne，Nicola M，et al. Characterization of a novel deletion causing- thalassemia major in an afghan family [J]. Hemoglobin，2010，34（1）∶110 -114.
[7]周晓光.我国β-地中海贫血基因诊断研究进展[J].中国优生与遗传杂志， 1997，5（3）：107.
编辑/哈涛