酶抑制—比色法检测聊城市果蔬有机磷和氨基甲酸酯农药残留
材料与方法
1.1 材料与试剂
果蔬共30个批次，398个样品，取样时间为2014年11月。蔬菜包括叶（花）菜类、鳞（根）茎类、甘蓝类、果菜类和豆类，水果包括浆果类、核果类、柑橘类等。大部分样品是从亚太农都交易市场随机抽取，少量由个体户、家庭农场或政府部门送检。
检测所用试剂购自深圳市安鑫宝科技发展有限公司。试剂配制方法和保存条件如下：
缓冲溶液，1包磷酸缓冲剂加1 000 mL去离子水，搅拌溶解，制成pH 8.0缓冲溶液，室温保存。显色剂，1瓶显色剂加25 mL缓冲溶液，4 ℃冰箱保存。底物，1瓶底物加入10 mL缓冲溶液，4 ℃冰箱保存。乙酰胆碱酯酶，1瓶酶液加18 mL缓冲溶液，4 ℃冰箱保存。
1.2 仪器与设备
SPR-88C型高速大容量农残检测仪，深圳市安鑫宝科技发展有限公司；HY-5型回旋式振荡器，金坛市科兴仪器厂；JY/YP2002型电子天平，精确度0.01 g，上海上天精密仪器有限公司；KQ-100B超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；微量移液器，规格0～5 mL、20～200 μL、5～50 μL；定性滤纸、烧杯、秒表、温度计、湿度计等。
1.3 试验方法
1.3.1 试验步骤 试验步骤如下：待检样品处理→检测板加样→抑制反应→显色反应→检测→结果判定→复检。
1.3.2 检测方法 参照文献[23]进行。
1）样品的提取。对于体积较大的水果、果实类蔬菜，去掉表面泥土，用削皮器取皮，剪成1 cm2左右的小块，称取2 g放入烧杯中，加入10.00 mL缓冲液，振荡器振荡提取2 min，过滤取滤液，静置3～5 min待用。对于蒜、山楂、枣、葡萄等较小的样品采用整颗浸泡的方法，对于葱、韭菜等容易出现假阳性的样品用分段提取的方法。
2）样品的检测。用微量移液器在安鑫宝专用的检测板的A1、A2、A3、A4 4个孔位分别加入150 μL缓冲溶液为空白对照，其余孔位分别用移液器加入150 μL的样品提取液。各孔位均加入50 μL酶液、50 μL显色剂。检测板放入通道内设置振板速度为中速，振动10 s，静止10 min，加入20 μL底物，迅速放到通道内振动10 s，点击开始检测，仪器便开始自动检测，3 min后仪器显示吸光度变化和抑制率等结果。
1.4 结果判断
以吸光度变化或抑制率判断结果。样品提取液对酶的抑制率在40%～50%之间时为弱阳性，样品提取液抑制率大于50%时为阳性，小于40%为阴性。对于阳性结果的样品需要重复检验2次以上。
抑制率=×100%；式中，ΔA0为对照溶液反应3 min吸光度变化值；ΔAt為样品溶液反应 3 min吸光度变化值。
2 结果与分析
2.1 空白组对果蔬农药残留影响试验
2.1.1 同一空白对照组样品吸光度与抑制率的关系 对外部送检的22份样品分两批次进行检测，选择同一空白对照组的部分原始检测结果进行分析，见表1和图1。有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，其抑制率与农药浓度呈正相关。即在一定条件下，样品农药残留浓度越高，其吸光度变化值越小，抑制率越大。
2.1.2 不同空白对照组对样品检测结果的影响 以所抽检的娃娃菜为研究对象进行平行与对照检测[24]，选择符合要求的空白对照组进行数据分析（图2），1-3孔位为同一空白对照组，4-6为同一空白对照组。可见，样品平行测定结果在误差允许范围之内，抑制率变化幅度较吸光度变化值大。在不同批次不同样品农残比较时，用吸光度变化值判断要比抑制率更准确。
2.2 果蔬样品农药残留检测
统计30个批次398个样品的农药残留情况，未检出农药超标样品。对检测数据进行分析（表2）并比较农药残留（图3）。样品种类中，农药残留为叶菜类<果菜类<根茎类<水果类；在蔬菜中，农药残留为萝卜>蒜薹>芫荽>菠菜>芹菜>黄瓜>胡萝卜>娃娃菜>西红柿>扁豆>菜花>辣椒>白菜；水果农药残留为柑橘>苹果>梨>山楂。萝卜、蒜薹、芫荽农药残留检测结果偏高，可能是其次生物质干扰所致。
3 小结与讨论
3.1 结论
样品农药残留为叶菜类<果菜类<根茎类<水果类，在蔬菜中农药残留为萝卜>蒜薹>芫荽>菠菜>芹菜>黄瓜>胡萝卜>娃娃菜>西红柿>扁豆>菜花>辣椒>白菜，水果中农药残留为柑橘>苹果>梨>山楂。并未检出农药残留超标样品。
3.2 注意事项
酶抑制-比色法进行农药残残留检测，需要注意一些问题，控制不确定因素的影响[25]。
3.2.1 胆碱酯酶的影响 ①为确保酶的活性，酶试剂及底物要在低温条件下保存。②检测前需将试剂从冰箱取出，恢复至室温后再进行检测，避免因低温影响酶的活性。③如环境温度变化较大，检测时间对结果影响较大，需重新进行对照测量。④加入的各种试剂量必须准确，多加或少加都会影响检测结果。⑤加入底物时动作要迅速，否则检测时间出现偏差，影响数据准确性。
3.2.2 样品处理的影响 样品含有大量色素，如紫甘蓝、胡萝卜；或大量汁液，如山药、柠檬；或丰富的胶质和纤维素，若处理不当，会干扰显色，影响检测结果。制样时，样品表面泥土较多应擦去而不能用水冲洗。取样要具有代表性，叶菜最好选取不同植株叶片的叶尖部分，样品不能太碎，以免色素释放。削皮取样要防止将汁水带入。除此之外，要严格控制提取时间，时间过短不能充分提取，过长会将色素浸出。样品混浊时使用定性滤纸过滤或者延长静置时间。部分果蔬如葱、姜、蒜、韭菜、辣椒、胡萝卜、芹菜、芫荽、茭白、蘑菇中含有酶抑制物质，与农药作用效果相似，应针对不同情况采取措施[26]。
3.3.3 操作者的影响 检测过程主要是微量试剂间进行反应，注意移液枪的使用，吸取液体之前要进行润洗。试验中配液用水均为一级纯净水，不可用桶装纯净水代替，容器使用前要严格按照自来水冲洗→超声波清洗→自来水荡洗→纯净水冲洗2～3遍→倒置晾干步骤进行清洗，防止残留污染待检测液。
3.2.4 酶抑制法检测农药种类有限 酶抑制法只能检测蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留，对某些硫代磷酸酯类农药（如伏杀硫磷）和菊酯类农药灵敏度不高，只能用于蔬菜的初筛。后续需对农药超标量进行定性定量分析，方能作出结论。
3.3 展望
酶抑制法快速检测农药残留技术减少了工作量，提高了分析效率，保证流通蔬菜的安全性。酶试剂对快检仪的检测结果有直接影响，在应用农残快检仪进行快速筛查检测时，对同一批样品最好使用同一批次、同一来源的酶试剂，以避免酶差异对结果的影响。植物的某些成分会对酶反应产生干扰，影响结果的准确度。因此在提高酶源稳定性和灵敏性，改进样品提取工艺等方面，还需进一步研究探讨，使快速农药残留检测技术更便捷、更准确。
参考文献：
[1] 史长生.农药残留危害以及检测技术的分析[J].食品研究与开发，2010，31（9）：218-221.
[2] 严锦申，李俊丽，赵 莉，等.农药残留现状及检测技术的研究进展[J].山东农业科学，2013，45（6）：134-137，152.
[3] 宋云华.蔬菜中农药的污染现状与控制对策研究[J].现代农业科技，2008（1）：59-62.
[4] 佟俊旺，李 君，王 颖，等.唐山部分市区市售蔬菜有机磷及氨基甲酸酯类农药残留调查[J].现代预防医学，2009，36（20）：3836-3839.
[5] 曹小丽，刘素华，楊晓倩，等.济南市2009-2012年蔬菜中农药残留检测结果分析[J].中国公共卫生管理，2013，29（3）：328-329.
[6] 苟艳丽.济宁市蔬菜质量安全检测分析[J].现代农业科技，2012（2）：348-349.
[7] 黄哲敏，郑如聪.2009年漳州市常见蔬菜、水果、茶叶农药残留调查[J].预防医学论坛，2011，17（2）：155-156.
[8] 邓 波，王珊珊，陈国元.2007-2011年全国蔬菜农药残留状况规律分析[J].实用预防医学，2013，20（2）：253-256.
[9] 孙 强.鄂州市2007-2010年市售蔬菜中农药残留监测结果分析[J].公共卫生与预防医学，2011，22（3）：86-88.
[10] 张 莹，郝东方，杨金丹，等.哈尔滨市售蔬菜水果有机磷农药残留检测分析[J].中国公共卫生，2010，26（4）：400-402.
[11] 金旭忠，徐庭巧，何良兴.杭州市市供豇豆有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留监测结果分析[J].中国卫生检验杂志，2012，22（6）：1372-1374.
[12] 尚 轶，卢忠魁.吉林省市售蔬菜农药残留状况调查[J].中国卫生工程学，2012，11（3）：236-237，241.
[13] 万春先，杨淑玉.农药中毒因素剖析及预防[J].农药科学与管理，1995（1）：30-31.
[14] 郑永权.农药残留研究进展与展望[J].植物保护，2013，39（5）：90-98.
[15] 王 文，刘 瑾，盛伟楠，等.采用酶抑制法检测大蒜中农药残留的改进方法[J].食品科学，2013，34（12）：135-139.
[16] 易 涛，赵明明，路 磊，等.酶试剂法快速检测常用农药残留的比较研究[J].湖北农业科学，2012，51（21）：4873-4875.
[17] 杜美红，孙永军，汪 雨，等.酶抑制-比色法在农药残留快速检测中的研究进展[J].食品科学，2010，31（17）：462-467.
[18] 王金斌，谭芙蓉，王利刚，等.乙酰胆碱酯酶酶抑制法快速检测农药残留的研究进展[J].上海农业学报，2009，25（4）：131-135.
[19] 郑 斌，黎其万，邵金良，等.温度对酶抑制法测定蔬菜有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的影响[J].广东农业科学，2012（3）：108-109.
[20] 王文祥，胡美英，刘茜清，等.兔血清乙酰胆碱酯酶用于农药残留速测的最佳条件研究[J].食品科学，2006，27（3）：179-183.
[21] 李卫霞.一线胆碱酯酶酶法在农药残留检测中的应用及质量控制[J].湖南农业科学，2010（3）：71-73，76.
[22] 裘正军，陆江峰，何 勇.基于酶抑法的农产品农药残留快速检测系统及影响因素分析[J].农业工程学报，2001，23（9）：229-234.
[23] GB/T5009199-2003，蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测[S]
[24] 伍树芬，何立媛，曾成柱，等.农药残留快速测定仪的常见问题及注意事项[J].广州科技，2013，7（14）：248-249.
[25] 赵艳华.农产品农药残留速测中常见影响因素的探讨[J].吉林农业，2012（3）：13-14.
[26] 桑园园，柴丽娜，魏朝俊，等.酶抑制法检测4种辛辣蔬菜农药残留假阳性消除的研究[J].中国农学通报，2009，25（11）：60-64.