苦荞麦麸中黄曲霉毒素B1提取工艺的优化
材料与方法
1.1 材料
苦荞麦麸：从西昌航飞科技发展有限公司采集苦荞麦麸皮粉。
1.2 仪器设备
酶标仪，美国热电公司生产;MS2型微量振荡器，德国IKA公司生产;微量移液器，芬兰雷勃公司生产;超声波细胞粉碎机，浙江宁波新芝生物科技股份有限公司生产;恒温培养箱，上海悦丰仪器仪表有限公司生产。
1.3 试剂
ELISA试剂盒，北京华安麦科生物技术有限公司;甲醇、无水乙醇、三氯甲烷、分析纯。
1.4 试验方法
1.4.1 空白溶剂加标回收试验 将溶剂甲醇和水按1 ∶ 9、8 ∶ 2、7 ∶ 3、6 ∶ 4、5 ∶ 5的比例配制。在空白提取溶剂中加入不同量的黄曲霉毒素B1标准品，使其每组最终浓度分别达到0.1、1.0、2.0 μg/L[1]。用ELISA法检测，同时做5组平行。按如下公式计算：
回收率=检测出AFB1的含量添加入的AFB1的含量×100%。 1.4.2 样品加标回收试验 将甲醇和水按1 ∶ 9、8 ∶ 2、7 ∶ 3、6 ∶ 4、5 ∶ 5的比例配制。准确称取2.0 g苦荞麦麸样品，装入25 mL具塞离心管中，准确加入 10 mL提取溶液，超声振幅为3Φ，超声萃取10 min，离心取上清液，即为待测样品提取液。测定原样品中黄曲霉毒素B1的含量，按1 ∶ 1比例加入浓度分别为0.1、1.5、5.0 μg/L的黄曲霉毒素B1标准品50 μL[2]。用ELISA检测。按如下公式计算：
回收率=总的AFB1含量-原样品中AFB1含量添加入AFB1的量×100%。
1.4.3 不同料液比对黄曲霉毒素B1提取的影响 用6 ∶ 4的甲醇作溶剂，准确称取2.0 g苦荞麦麸样品，装入25 mL具塞离心管中，按照料液比1 g ∶ 4 mL、1 g ∶ 5 mL、1 g ∶ 6 mL、1 g ∶ 7 mL、1 g ∶ 8 mL、1 g ∶ 9 mL加入溶剂，超声振幅为3Φ，超声波萃取10 min，离心取上清液，即为待测样品提取液[3]，用ELISA检测。
1.4.4 不同超声时间对黄曲霉毒素B1提取的影响 选用提取溶剂比6 ∶ 4和料液比1 g ∶ 5 mL进行试验，准确称取2.0 g苦荞麦麸样品，装入25 mL具塞离心管中，准确加入10 mL提取溶液，超声波萃取，振幅为3 Φ，时间分别采用5、10、15、25、35、50 min，离心取上清液，即为待测样品提取液[4]，用ELISA检测。
1.4.5 不同超声振幅对黄曲霉毒素B1提取的影响 采用最佳提取溶剂6 ∶ 4、料液比1 g ∶ 5 mL、超声时间15 min进行试验，准确称取2.0 g苦荞麦麸样品，装入25 mL具塞离心管中，准确加入10 mL提取溶液，超声波萃取，振幅分别为3、6、10、15、20 Φ，离心取上清液，即为待测样品提取液。用ELISA检测。
1.4.6 正交试验 根据正交试验原理，选取料液比（A）、超声时间（B）、超声振幅（C）对黄曲霉毒素B1提取影响显著的3个因素，每个因素3个水平，选用L9（33）正交表，并对数据进行极差分析，最后在一定水平范围内取最佳值[5]。正交试验因素与水平设计见表 1。
1.5 苦荞麦麸中黄曲霉毒素B1含量的测定
1.5.1 样品处理 取经过上述超声处理后的提取溶剂 5 mL，加入10 mL三氯甲烷，振荡5 min，离心分层， 取出下层
表1 苦荞麦麸中黄曲霉毒素B1提取工艺正交试验因素水平
水平
因素
A：料液比
（g ∶ mL） B：超声时间
（min） C：超声振幅
（Φ）
1 1 ∶ 4 10 10
2 1 ∶ 5 15 15
3 1 ∶ 6 20 20
三氯甲烷相;向上层水相中再加入10 mL三氯甲烷，按上述方法重复提取1次，合并三氯甲烷相;于50 ℃下水浴蒸干;加入2 mL样品提取液，溶解挥干物;再加入8 mL样品稀释液进行稀释;取稀释后液体待测。
1.5.2 加标准品/样本 将样本和标准品对应微孔按序编号，并记录标准孔和样本孔所在的位置，加入标准品或样本50 μL到对应的微孔中，加AFB1酶标物50 μL/孔，再加入AFB1抗试剂50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 37 ℃ 避光环境中反应30 min。
1.5.3 洗板 小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300 μL/孔，充分洗涤5次，每次间隔30 s，用吸水纸拍干。
1.5.4 显色 加入底物液A液50 μL/孔，再加底物液B液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37 ℃避光环境反应15 min。
1.5.5 测定 加入终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于双波长D450 nm/D630 nm检测，在5 min内读完数据，测定每孔D值。
1.5.6 ELISA试验标准曲线 用ELISA标准品作标准曲线，标准品浓度分别为0、100、250、500、1 500、5 000 ng/L进行3次重复试验，取平均值。利用RIDAWIN软件分析得到标准曲线，结果如图 1。
2 结果与分析
2.1 空白溶剂加标回收试验
ELISA检测过程中会受到试剂、温度、仪器灵敏度等因素的影响。为了研究提取溶剂本身对ELISA的影响，比较不同溶剂的回收率。按照“1.4.1”节方法进行5次重复试验，取平均值。计算加标回收率，试验结果见表2。
表2 空白溶剂加标回收试验结果
提取溶剂
（甲醇 ∶ 水）
添加100 ng/kg
AFB1 1 000 ng/kg
AFB1 2 000 ng/kg
AFB1
检测值
（ng/kg） 回收率
（%） 检测值
（ng/kg） 回收率
（%） 检测值
（ng/kg） 回收率
（%）
9 ∶ 1 81.4 81.4 1 178.1 117.8 1 933.7 96.7
8 ∶ 2 82.5 82.5 1 196.3 119.6 1 893.3 94.7
7 ∶ 3 88.7 88.7 967.1 96.7 1 804.3 90.2
6 ∶ 4 109.2 109.2 877.1 87.7 1 780.2 89.0
5 ∶ 5 114.2 114.2 924.5 92.5 2 372.2 118.6
由表2可知，直接用不同溶剂配比进行加标试验，不同提取方法的回收率在81.4%～119.6%之间。根据回收率在70%～120%之间可行，结果表明，采用上述提取溶剂，并用ELISA检测是可行的。
2.2 样品加标回收试验
苦荞麦麸中可能含有某些干扰物质，对提取效果会有一定干扰。为了研究样品中干扰物质对苦荞麦麸中黄曲霉毒素B1提取的影响，按照“1.4.2”节方法进行5次重复试验，取平均值，计算加标回收率，试验结果见表3。
表3 样品加标回收试验结果
提取溶剂
（甲醇 ∶ 水） 稀释10倍后样品中
AFB1的含量（ng/L）
添加100 ng/L 添加1 500 ng/L 添加5 000 ng/L
检测值（ng/L） 回收率（%） 检测值（ng/L） 回收率（%） 检测值（ng/L） 回收率（%）
9 ∶ 1 101.1 121.1 141.1 703.5 87.06 1 867.2 72.67
8 ∶ 2 139.2 134.2 129.2 687.4 82.37 2 315.8 89.85
7 ∶ 3 117.1 119.9 122.7 637.6 77.21 2 555.4 99.87
6 ∶ 4 102.1 108.1 114.1 735.2 91.22 2 430.9 95.19
5 ∶ 5 135.4 141.0 146.6 572.2 67.27 1 933.7 74.64
由表3可知，在甲醇 ∶ 水比例为9 ∶ 1、8 ∶ 2、7 ∶ 3、5 ∶ 5时回收率均达到120%以上，不符合回收率的可行标准[6]，在甲醇 ∶ 水比例为6 ∶ 4时，回收率在91.22%～114.1%之间，最接近100%，回收率最好，即是黄曲霉毒素B1提取时，提取效果最好。因此宜采用甲醇 ∶ 水比例为6 ∶ 4的提取溶剂。
2.3 不同料液比对黄曲霉毒素B1提取的影响
不同的料液比对黄曲霉毒素提取有不同影响，选择甲醇 ∶ 水比例6 ∶ 4为提取溶剂，按照“1.4.3”节方法进行5次重复试验，取其平均值。试验结果见图2。
由图2可知，在料液比为1 g ∶ 5 mL时，测得的黄曲霉毒素B1的含量最高，表明在料液比为1 g ∶ 5 mL时，提取液的提取效果最好。产生该变化趋势的原因可能是，当料液比大于1 g ∶ 5 mL时，样品与溶剂的接触不够，不能充分溶解，导致黄曲霉毒素B1提取不完全;当料液比达到1 g ∶ 5 mL时，正好达到最佳溶解状态;当料液比小于1 g ∶ 5 mL时，黄曲霉毒素B1的溶解量减少，导致检测的含量减少，曲线呈下降趋势[7]。
2.4 不同超声时间对黄曲霉毒素B1提取的影响
采用不同的超声时间对黄曲霉毒素B1进行提取，按照“1.4.4”节方法进行5次重复试验，取其平均值。试验结果
见图3。
由图3可知，在超声时间为15 min时，提取的黄曲霉毒素B1含量最高，即是超声时间为15 min时，黄曲霉毒素B1提取效果最好。当超声时间低于15 min或高于15 min时，检测含量呈缓慢下降的趋势，即黄曲霉毒素B1提取含量减少。产生该变化趋势的原因可能是在超声时间低于15 min时，超声强度不够，苦荞麦中黄曲霉毒素B1溶解不完全;当超声时间为15 min时，苦荞麦中黄曲霉毒素B1提取达到较为完全的状态，含量最高，提取效果最好;当提取时间超过15 min时，由于苦荞麦在溶剂中浸泡时间过久，导致苦荞麦中黄曲霉毒素B1有少量降解的现象[8]。
2.5 不同超声振幅对黄曲霉毒素B1提取的影响
使用不同的超声振幅进行试验，按照“1.4.5”节方法进行5次重复试验，取其平均值，试验结果见图4。
由图4可知，随着超声振幅的增加黄曲霉毒素B1的含量维持在1 064.6～1 053.7 ng/L之间，苦荞麦中黄曲霉毒素B1含量相对稳定。超声振幅在15Φ时，苦荞麦中黄曲霉毒素B1含量最高，提取效果最好。产生该变化趋势的原因可能是当超声振幅小于15Φ时，苦荞麦中黄曲霉毒素B1溶解不够充分，造成少量差异;当超声振幅大于15Φ时，振幅过高造成黄曲霉毒素B1少量降解[9]。
2.6 苦荞麦麸中黄曲霉毒素B1提取正交试验
按照“1.4.6”节方法进行正交试验，试验结果如表4。
表4 苦荞麦麸中黄曲霉毒素B1提取正交试验结果
序号 A：料液比 B：超声
时间 C：超声
振幅 AFB1含量
（ng/L）
1 A1 B1 C1 1 012.5
2 A1 B2 C2 1 037.2
3 A1 B3 C3 1 026.9
4 A2 B1 C2 1 041.2
5 A2 B2 C3 1 060.8
6 A2 B3 C1 1 038.1
7 A3 B1 C3 1 023.1
8 A3 B2 C1 1 051.3
9 A3 B3 C2 1 032.8
k1 1 025.5 1 025.6 1 034.0
k2 1 046.7 1 049.8 1 037.1
k3 1 035.7 1 032.6 1 036.9
R 21.2 24.2 3.1
由表4 分析可知，3种因素对黄曲霉毒素B1提取效果影响大小依次为B>A>C，即超声时间>料液比>超声振幅。根据正交试验得到黄曲霉毒素B1含量，可以得出最优的提取条件为A2B2C2，即料液比为1 g ∶ 5 mL，超声时间为 15 min，超声振幅15Φ。
按照A2B2C2的最佳组合进行验证试验，同时进行3次平行试验。用ELISA检测后测得其含量为1 065.1 ng/L。
3 结论
根据国标GB/T 5009.23—2006《食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定》、GB/T 18979—2003《食品中黄曲霉毒素的测定》中选择适当的溶剂配比进行空白加标回收试验，回收率在81.4%～119.6%之间，表明采用ELISA检测黄曲霉毒素B1是可行性。
正交试验结果表明，超声波提取苦荞麦麸中黄曲霉毒素B1的最佳工艺条件为溶剂配比6 ∶ 4，料液比为1 g ∶ 5 mL，超声时间为15 min，超声振幅15Φ。在此条件下提取黄曲霉毒素B1的含量为1 065.1 ng/L，高于同等条件下常规提取含量 1 055.0 ng/L。
此外，苦荞麦中黄曲霉毒素B1提取方法中因内部提取溶剂及外部环境因素等要求复杂，影响提取因素多，在实际工作中还应做其他条件的优化，如溶剂、温度、湿度、pH值等，因工作量大而时间有限，本试验仅对苦荞麦中黄曲霉毒素B1作初步的优化设计。
参考文献：
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