SDF—1在胃癌中的表达变化及其临床意义

摘要：目的 通过检测SDF-1在胃癌和癌旁正常组织中的表达，分析其与患者临床病理特点的关系，进而推论SDF-1在胃癌发生发展过程中可能扮演的角色。方法 用RT-PCR和免疫组化法检测52例诊断明确的胃癌患者的SDF-1在胃癌组织以及癌旁正常组织中的表达情况，并结合临床病理特点进行统计分析。结果 免疫组化方法测得，胃癌组织中SDF-1蛋白的阳性率显著高于癌旁组织，分别为94.2%和5.8%，差异有统计学意义（P<0.05）；RT-PCR测得SDF-1基因在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）。胃癌组织中SDF-1基因的表达在HP阳性胃癌患者中的表达显著高于HP阴性胃癌患者；在分期较晚、浸润深度越深、淋巴结转移越多及分化程度较差的胃癌患者中的表达显著高于分期早，浸润深度越浅、淋巴结转移越少以及分化程度较好的胃癌患者（P均<0.05）；其表达水平与肿瘤位置、患者性别、年龄以及术前外周血CEA、CA19-9水平不相关（P均>0.05）。结论 SDF-1基因和蛋白在胃癌组织中的表达均显著高于癌旁组织，提示其可能在胃癌的发生过程中作为一种致癌基因扮演着重要角色；HP感染增强SDF-1的致癌作用，SDF-1可以作为判断胃癌患者预后的指标，但不能作为推测复发的指标。

关键词：SDF-1；胃癌；病理学特征；幽门螺旋杆菌

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，全球每年有超过90万的新确诊病例和大约70万的胃癌患者死亡[1]。在我国其发病率和死亡率占各种消化系统恶性肿瘤之首。从基因水平研究胃癌的发生发展对提高胃癌的治疗效果具有重要意义。基质细胞衍生因子1（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1，又称CXCL12），是CXC趋化因子家族的成员，其与受体CXCR4结合参与机体造血、干细胞生成、白细胞浸润、神经、血管和心脏的形成以及HIV感染等一系列生理病理过程。近年来研究发现，SDF-1与多种肿瘤发生、浸润、转移有关[2-4]。本研究采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）以及免疫组织化学的方法，检测胃癌组织和癌旁正常组织中SDF-1的表达，探讨SDF-1与相关临床病理指标的相关性，研究其与胃癌增殖、浸润、转移的关系，判断SDF-1基因能否作为预后及推测复发的指标。

1资料与方法

1.1一般资料 收集2011 年4～7月川北医学院附属医院胃肠外科的胃癌手术标本（包括癌组织和癌旁6 cm以上胃黏膜组织）52例，含男41例，女11例；年龄31～79岁，平均（58.6±11.7）岁。据NCCN 2012 版胃癌TNM 分期标准[5]：Ⅰ期15 例，Ⅱ期8 例，Ⅲ期19 例，Ⅳ期10 例。据NCCN 2012 版胃癌淋巴结转移分级标准[5]：N0 20 例，N1 10 例，N2 14 例，N3 8 例。肿瘤分化程度：高分化癌2 例，中分化癌14 例，低分化癌36 例。肿瘤部位：胃上1/3者13例，中1/3者14例，下1/3者25例。据UICC1997年公布的胃癌TNM分期法[6]，T1：10例，T2：10例，T3：32例。所有病例均经术前胃镜活检和术后病理学检查证实为胃癌，且近期均未服用过抗幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，HP）药物或行放化疗治疗。

1.2主要试剂与仪器 TRNzol，天根生化科技（北京）有限公司；逆转录试剂盒及RT-PCR 试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司；免疫组织化学SDF-1一抗（单克隆，鼠抗人）及免疫组织化学二抗试剂盒，ABCAM 公司；DAB 试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；定量PCR 仪，ABI 公司。

1.3 HP检测 14C-尿素呼吸试验兼简单、快速以及价廉于一体，灵敏度>95%，特异度高于90%，为HP感染的一线定性诊断方法[7]。本研究术前即采用14C-尿素呼吸试验的方法检测患者HP值，<100 dpm为阴性，≥100 dpm为阳性。有11例患者因胃食管结合部完全梗阻而未做此项检查。

1.4 RT-PCR 法检测SDF-1 基因的表达

1.4.1总RNA的提取和逆转录 剪取一定量的组织，用液氮研成粉末后按比例加入TRNzol，按TRNzol说明书进行总RNA的提取，用焦炭酸二乙酯处理后的水（简称DEPC水）溶解RNA，并检测RNA的质量，按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。

1.4.2 RT-PCR 检测SDF-1和β-actin引物由上海Invitrogen公司合成。引物序列及产物大小，见表1。反应体系及扩增条件见表1。2-△Ct为基因的相对表达量，其中△CT 为RT-PCR 检测SDF-1 所得的CT 值与检测β-actin 所得的CT 值之差。△CT 值越高，基因表达越低。

1.5免疫组织化学法检测SDF-1蛋白的表达 切烤片，依次置二甲苯溶液、无水乙醇、85% 乙醇、75% 乙醇，0.01MPBs（PH7.4）漂洗；3%过氧化氢溶液室温避光封闭；置枸橼酸溶液进行高温抗原修复；滴加一抗，二抗；滴加DAB显色，苏木精复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗蓝化；吹干，封片。用非肿瘤患者正常胃黏膜组织作为阳性对照，用PBS 代替一抗作为阴性对照[8]。

阳性结果判定根据以下两方面的总分进行判断：①选染色均匀的阳性表达肿瘤区域，5个高倍视野计数阳性细胞，以阳性细胞所占百分比为五级计分：阳性细胞率<5%为0分；阳性细胞率5%～25%为1分；阳性细胞率26%～50%为2分；阳性细胞率51%～75%为3分；阳性细胞率>75%为4分。②按染色强度来分：不着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分。两种评分相加，0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为阳性（++），6～7分为强阳性（+++），以上方法均由两名病理医师采用双盲法独立检测，取平均值[9]。

1.6统计学方法 采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，胃癌与癌旁组织的△Ct值比较采用配对样本t检验，按临床病理学特征分组后各组癌组织的△Ct 值两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；免疫组织化学结果采用配对χ2检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.1 RT-PCR 检测SDF-1在胃癌和癌旁组织中的表达情况 SDF-1基因在胃癌组织中的表达高于癌旁组织，其△Ct 值之差为（-10.74±1.87），差异有统计学意义（t=42.50，P<0.01），见图1。

图1 RT-PCR检测SDF-1基因在癌组织及癌旁组织中的表达情况

2.2免疫组织化学检测结果 SDF-1蛋白在胃癌组织中的表达阳性率为 94.2%（49/52），明显高于其在癌旁正常组织中的表达阳性率5.8%（3/52），差异有统计学意义（P<0.01），见表2、图2。

图2 免疫组化结果：A胃癌组织 阳性（x200），B 癌旁组织 阴性（x200）

2.3胃癌组织中SDF-1基因表达与其临床病理学特征的关系 不同肿瘤分期、分化及淋巴结转移程度、浸润深度以及HP阳性与阴性的胃癌患者，胃癌组织中SDF-1 基因的表达差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。不同性别、年龄、肿瘤部位以及术前外周血CEA 和CA19-9阳性与阴性的胃癌患者，胃癌组织中SDF-1 基因的表达差异均无统计学意义（P>0.05），见表4。

3讨论

SDF-1由Tashiro首先在P6系小鼠骨髓基质细胞分泌的细胞因子中发现，通过表达克隆的方法分离得到它的cDNA[10]。其基因位于10 号染色体长臂上，SDF-1cDNA长1776bp，属于趋化因CXC受体家族，编码的受体为CXCR4，是与G 蛋白耦联的部位。国外学者[11]首先发现其在卵巢癌细胞中高表达，后来在乳腺癌[2]、前列腺癌[3]、宫颈癌[12]、肺癌[13]等研究中发现，SDF-1的表达与肿瘤的生长、增殖、侵袭转移有关。SDF-1 广泛表达于多种细胞和组织中，包括免疫细胞、脑、心脏、肾、肝、肺和脾，在免疫系统、循环系统及中枢神经系统的发育中起着至关重要的作用[10，14]。SDF-1 调控人体多种生理病理过程，包括心脏和神经元的发育、血管发生、干细胞迁移、新生血管形成、凋亡和肿瘤发生。SDF-1与其受体CXCR4 的结构和相互作用机制是发挥其病理、生理功能的基础。

有研究[15]发现，SDF-1的过表达通过对间质肌纤维母细胞和上皮细胞的祖细胞扩增，诱导胃黏膜不典型增生。从癌旁胃黏膜→胃癌前病变→早期胃癌→进展期胃癌，胃黏膜组织中SDF-1的表达水平逐渐升高，可见其表达变化贯穿胃组织癌变的全过程，在胃癌的发生、发展过程中扮演着重要角色。如果能够通过研究发现它与胃癌某些病理学特征的关系，那么术前胃镜下活检将有助于对肿瘤的初步评估，指导临床治疗，然而类似的研究在国内很少。SDF-1的表达与胃癌外周血CEA 和CA19-9 水平及HP值是否有关，目前国内外研究尚无报道，其与胃癌患者病理学特征如临床分期、淋巴结转移以及与患者性别、年龄的关系，目前国内研究也较少，值得我们进一步深入研究探讨。本研究采用RT-PCR 和免疫组织化学的方法分别从基因和蛋白质两个水平检测SDF-1在胃癌和癌旁正常组织中的表达，并结合患者的临床资料和肿瘤病理学特征进行比较分析，以期探索上述问题。

本研究结果显示，无论在基因还是蛋白质水平，胃癌组织SDF-1的表达均高于癌旁正常组织，从而印证了它是一种致癌基因[2-3，11-13]的结论。Shibata[15]的研究发现当SDF-1转基因小鼠与感染幽门螺杆菌的猫鼠杂交后在致胃癌作用上有协同效应，本研究结果证实SDF-1基因与HP感染与胃癌的发生发展呈正相关，且与肿瘤浸润深度与分期正相关，这与Ishigami[16]的研究结论一致。陈友权[17]的研究表明SDF-1的表达与肿瘤的组织学分级呈正相关，本研究结果显示SDF-1的表达在低分化程度的胃癌患者中显著高于中高分化程度的胃癌患者；本组结果亦提示SDF-1基因表达与淋巴结的转移程度相关而与肿瘤位置无关，这与Iwasa[4]的研究结果吻合。另外，本研究还发现，胃癌患者癌组织中SDF-1基因的表达与其性别和年龄均无关，提示SDF-1基因的表达无性别差异，也不会随着年龄的增加而增减。CEA和CA19-9检测值可用于胃癌患者复发的评估[18]，本研究发现胃癌组织中SDF-1基因的表达与患者术前外周血CEA 和CA19-9 的水平均无关。因此推测SDF-不能作为推测复发的指标。我们下一步需要随访本实验胃癌患者的复发情况，再分析SDF-1基因与患者复发的关系，进一步证实SDF-1基因可用于胃癌患者复发的评估。另外， SDF-1基因在胃癌发生、发展过程中的作用机理目前尚无明确的定论，有待进一步深入的研究。

参考文献：

[1]吴阶平，裘法祖，吴孟超，等.黄家驷外科学[M].7版.北京：人民卫生出版社，1450.

[2]车晓波，刘文忠.幽门螺杆菌常用诊断方法的评价[J].中华消化杂志，2002，22（11）：691-693.

[3]陈佳慧，肖江卫，任明扬，等.gastrokine 1在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系[J].中国普外基础与临床杂志，2012，10（10）：1089-1093.

[4]沈晓燕，王绍海，梁铭霖，等.CXCR4 及其配体SDF-1在宫颈癌转移中的作用及其机制研究[J].癌症，2008，27（10）：1044-1049.

[5]陈友权，于燕妮.胃癌中SDF-1、CXCR4、MMP-2和MMP-9的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志，2012，28（2）：135-139.

编辑/张燕

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