电针对坐骨神经损伤大鼠脑源性神经营养因子的影响
材料
1.1 动物
SPF级成年雄性Wistar大鼠50只，体质量（200±20）g，上海中医药大学动物实验中心，动物许可证号SYXK（沪）2014-0008。饲养于上海中医药大学SPF级动物实验室，温度22～25 ℃，相对湿度40%～70%，每笼5只，人工光照时间为明暗交替12 h。
1.2 试剂
ELISA试剂盒（上海科夷生物科技有限公司），Anti-BDNF beta antibody（上海艾博抗贸易有限公司），TritonX-100（国药集团化学试剂有限公司），Goat Anti-Rabbit IgG-HRP（Jackson Immuno Research），DAPI染色液、抗荧光淬灭封片液（上海碧云天），OCT包埋剂（美国Thermo），Sucrose（美国Sigma）。
1.3 仪器
显微镜（上海光学仪器六厂），G6805A型电针治疗仪（常州英迪），无菌针灸针0.25 mm×13 mm，Micro 17R高速微量冷冻离心机（美国Fisher Scientific），超薄切片机（Leica，Switzerland），HM525冰冻切片机（Fisher Scientific），倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS），超低温冰箱（日本SANYO）。
2 实验方法
2.1 分组
采用随机对照实验设计，根据随机数字将50只健康雄性大鼠分为正常组（12只）、假手术组（12只）、模型组（13只）、电针组（13只）。
2.2 造模
大鼠适应性饲养1周后，腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，于右侧大腿后外侧切开皮肤，游离坐骨神经约2 cm，用刀片切除约5 mm神经，任其自行回缩后，再用12 mm长的硅胶管将两断端各嵌入2 mm，形成8 mm长的再生室[5]。肉眼直视下切除神经，测量断端嵌入的长度，在体式显微镜下通过缝线将两段固定，确定模型成功。
2.3 治疗
电针组造模后第2日开始治疗。治疗中按实验动物大鼠穴位图谱[6]，于大鼠后肢髋关节后上缘取“环跳”，于膝关节下1.5 cm处取“足三里”，采用华佗牌0.25 mm×13 mm针灸针，针刺深度为0.6～1 cm，稍行提插捻转手法。然后使用电针治疗仪，正、负电极输出线分别夹在“环跳”“足三里”上的毫针针柄上。选用断续波，频率5 Hz，以肌肉出现轻微抽动为度。针刺过程中不对大鼠进行麻醉和捆绑，用自制固定器对大鼠进行固定，每次20 min，每日1次，每周6次，共治疗4周。正常组为未进行造模的正常大鼠。假手术组具体操作与电针组相同，但不切断坐骨神经且不进行任何治疗。模型组造模后不进行任何治疗。
2.4 取材及处理
腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取出坐骨神经、脊髓L4～5节段，分别置于4%多聚甲醛中固定，然后转移至30%蔗糖中脱水，OCT包埋后放入-80 ℃保存，冰冻切片机切片（厚度20 μm），用于免疫荧光检测。部分坐骨神经脱水、浸蜡、包埋、切片（厚度4 μm），用于HE染色。血液采集：将大鼠麻醉后，于腹主动脉，抽取5 mL血液，置于离心管中静置2～3 h，待血凝后，3500 r/min离心10 min。由于部分样品出现溶血现象，选取血清分离成功的大鼠进行ELISA检测。取材完毕后，所有大鼠均断头处死。
2.5 HE染色
二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ依次浸泡1 h脱蜡。100%、95%、75%梯度乙醇水化。蒸馏水水洗3 min后，苏木精染色5 min核染。蒸馏水洗3 min后，1%盐酸乙醇分化30 s。蒸馏水洗，碳酸锂饱和溶液返蓝30 s，流水冲洗。5%伊红染液染色1 min。95%、100%梯度乙醇脱水。二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明。中性树胶滴入载玻片组织上封片。
2.6 免疫荧光检测
取出损伤远端神经、脊髓L4～5切片，置于室温干燥10 min，使组织充分贴在载玻片上。0.01 mol/L PBS浸泡5 min，去除包埋剂。室温0.5% Triton-X-100破膜15 min，增加细胞膜通透性。0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min。37 ℃烘箱内封闭30 min，封闭非特异结合位点。加入一抗anti-BDNF（1∶200），4 ℃冰箱过夜。次日取出，用含0.1%Triton-X-100的0.01 mol/L PBS洗3次，每次10 min。加入FITC/CY3标记二抗IgG（1∶100～1∶500），37 ℃烘箱内放置1 h。取出后用含0.1% Triton-X-100的0.01 mol/L PBS洗3次×10 min。室温DAPI染色10 min，染核。0.01 mol/L PBS浸泡10 min。甘油封片，镜下观察并拍照。
2.7 ELISA检测
取出损伤远端神经、脊髓L4～5切片后室温平衡20 min，于铝箔袋中取出所需板条。设置标准品孔（6个浓度）、样本孔和空白对照孔。稀释标准品；准备6只小试管，依次编码，標准品1～6浓度分别为20、10、5、2.5、1.25、0 ng/mL。依照标准品顺序分别加入50 μL标准品溶液于空白微孔中，空白对照孔加入50 μL蒸馏水，温育并洗涤后于标准品孔和样本孔中加入HRP标记的检测抗体50 μL。温育并洗涤各孔，加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育10～15 min。加入终止液50 μL，于450 nm波长处测定各孔光密度（OD），通过标准曲线计算各组BDNF浓度。
3 统计学方法
采用SPSS15.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析，并用SNK法做两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 HE染色结果
正常组和假手术组神经组织结构较为紧密，神经纤维排列规则，轴突较为粗大，髓鞘结构清晰可见，间质均匀淡染；模型组大鼠术侧神经组织结构疏松，神经纤维排列紊乱，无规律可循，整体染色较浅，轴突肿胀如泡沫状、崩解、脱髓鞘，单位视野内正常形态的轴突数量较假手术组明显减少，轴突多不规则或模糊不清，较为细小；电针组轴突再生数量明显多于模型组，且大体轮廓较为清晰，见图1。
4.2 免疫荧光检测结果
在损伤神经远端，模型组血清BDNF表达高于正常组和假手术组，电针组血清BDNF表达较模型组明显上调，见图2。脊髓L4～5节段模型组血清表达低于正常组和假手术组，电针组血清大鼠L4～5脊髓节段BDNF表达较模型组明显上调，见图3。
4.3 ELISA检测结果
模型组大鼠血清BDNF含量明显低于假手术组（P<0.01），电针组血清BDNF含量明显高于模型组（P<0.01），见表1。
5 讨论
中医对外周神经损伤及治疗方法认识较早，《内经》就提出“治痿独取阳明”的理论，“阳明者，五脏六腑之海，主润宗筋，宗筋主束骨而利机关也”，在治疗上注重整体观，同时根据个体情况不同，辨证论治，辨其虚实，要求做到因时因地因人制宜。针刺被应用于PNI临床治疗，其修复机制可能与PNI后修复过程中神经元、轴突的再生以及微环境改变有关[7]。
环跳属足少阳胆经之穴，是胆经与足太阳膀胱经交会穴，也是治疗下肢痿痹的要穴；足三里属足阳明胃经穴，为补益要穴。从现代医学角度看，这2个穴的位置深部分别为坐骨神经、腓深神经和胫神经的走行，电针刺激“环跳”“足三里”可直接作用于神经局部，从而促进血液循环、改善肌肉营养等，促进神经功能的恢复。现代研究表明，深刺“环跳”“足三里”能增加神经生长因子的表达，调节Fos蛋白水平从而加速损伤神经的修复，提高神经干电活动指数[8-9]。针刺上述腧穴后，分别在针柄上接通电针仪，电流调到接近人体本身生物电的微量电流，利用针和电2种刺激相结合，提高针刺治疗效果。研究表明，在弱电场作用下，神经元的突起向阴极方向生长加快，向阳极方向生长则受到抑制[10]。本实验根据其原理，将电针阳极连接“环跳”而阴极连接“足三里”，有利于神经从近心端向远心端的生长。陈家泽等[11]研究认为，低频（5 Hz）电针治疗对SNI大鼠肌肉萎缩有拮抗作用；另有实验表明，低频电针（5 Hz）对神经损伤后再生恢复作用优于高频电针（100 Hz）[12]。本实验结合文献报道，最终选取断续波、5 Hz低频，治疗中以肌肉出现轻微抽动为准，进行大鼠SNI的治疗，取得良好疗效。HE染色发现电针组轴突再生数量明显多于模型组，且大体轮廓较为清晰，表明电针对损伤模型大鼠神经轴突的恢复有一定的促进作用。
BDNF是神经营养因子（NTFs）家族中的一员，它是由德国神经生物学家Brade等在1982年从猪脑中分离出来的12.3 kD的小分子蛋白质[13]。BDNF缓释微球对PNI大鼠神经有保护作用[14]。BDNF表达水平越高，大鼠SNI修复程度越高[15]。BDNF的作用机制可能是与其高亲和力受体TrkB相结合，从而在神经损伤后修复中发挥作用，BDNF特别对感觉和运动神经有营养作用。
有实验表明，脊髓挫伤后，损伤局部组织细胞中BDNF的表达升高，从而促进受损脊髓神经元功能恢复[16]。神经损伤后，NTFs无法通过神经逆转到脊髓，故模型组脊髓中BDNF水平降低[17]。周围神经电刺激可促进相应脊髓节段及背根神经节表达BDNF[18-19]。本研究发现，大鼠SNI后，脊髓L4～5节段BDNF表达下调，这可能与“细胞体-轴突-靶器官”轴中断，导致NTFs不能沿着轴质逆行转运到神经元胞体有关，这也反映了神经损伤后出现的退变。而与模型组比较，电针可促进脊髓L4～5节段BDNF的表达，在一定程度上也反映了电针治疗有利于神经轴突的再生和恢复。
本研究还发现，SNI后血清BDNF表达较假手术组降低，这与神经组织中的表达情况相反。推测其原因可能为SNI后有更多的BDNF从血液运输到病变的神经组织中，以促进神经组织的修复和再生，从而导致血清BDNF较假手术组降低。而电针治疗不仅可以提高神经组织BDNF的表达，还能影响全身BDNF的水平，使血清BDNF水平明显升高，从而加快神经损伤的修复和再生。
综上，电针组较模型组在损伤神经远端、脊髓L4～5节段和血清BDNF的表达均上调，推断电针可能通过调控BDNF的表达对大鼠SNI功能的恢复起到一定的促进作用。
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（收稿日期：2016-07-13）
（修回日期：2016-08-20；编辑：华强）