复合益生菌对大菱鲆生长指标、血液生理生化指标的影响
摘 要：探讨复合益生菌对大菱鲆生长指标和血液生理生化指标的影响，结果表明复合益生菌作为饲料添加剂可以有效提高大菱鲆的增重率、特定生长率、饲料利用率，一定程度上影响了大菱鲆全鱼及背部肌肉的粗成分，但并没有影响大菱鲆血液生理生化指标。
关键词：益生菌；大菱鲆；生长指标；血液生理生化指标
大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）原产于欧洲，是一种冷水性底栖鱼类，易接受配合饲料而且转化率高，耐低氧且病害少，是北方海水养殖的优良品种[1]。
由于益生菌具有增强免疫力、促进生长、维持动物消化道环境等功能，因此可作为新的绿色的添加剂广泛运用于食品、医药、饲料等方面[2]。桂琳等研究发现添加复合益生菌的饲料能有效提高草鱼的特定生长率、增重率、饲料利用率[3]。李小梅等也发现以光合细菌、短小芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌组成的复合益生菌作为饲料添加剂能有效促进斜带石斑鱼的生长性能，如特定生长率、体增重率、体增长率、肥满度，且饲料系数也有所下降[4]。但是益生菌对大菱鲆生长的影响很少有报道。
动物机体的代谢过程中血液是动物体内循环系统的重要组成部分[5]。血液的生理生化指标是评价水产动物健康状况、营养状况及对环境的适应状况的重要指标之一[6]。目前关于水产动物血液生理生化指标的研究报道很多[7-9]，但是关于复合益生菌作为饲料添加剂对大菱鲆血液的影响很少报道。
因此本试验通过饲料中添加不同梯度的复合益生菌来探讨其对大菱鲆生长性能和血液的影响，以期为大菱鲆高效、健康养殖提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 益生菌的来源与鉴定
本试验所用复合益生菌由大连百安泰生物科技有限公司提供，该复合益生菌为菌液，根据Ran C. [10]的方法测定活菌总数为5×109 CFU/mL，在北京诺禾致源生物信息科技有限公司進行16s rDNA V4区鉴定，以相对丰度值大小为标准，该复合益生菌主要含有醋杆菌属（Acetobacter）、乳杆菌属（Lactobacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas），其相对丰度分别为0.82、0.14、0.002。
1.2 试验饲料的配制
根据Irfan Ambas等[11]的方法，试验饲料制备分为两个步骤，分别为基础饲料的制备和菌液的喷洒。
基础饲料的制备如下：饲料原料粉碎，过40目筛，利用搅拌机（B10高速三功能搅拌机）进行混匀，最后放入制粒机（东南干燥设备有限公司，XL-250）压成粒径分别为1.8 mm和2.0 mm的颗粒饲料，将制成的饲料放入烘箱中40 ℃烘干至水分为8%左右。基础饲料的配方主要有鱼粉、鱼油、大豆卵磷脂等，具体饲料配方及营养成分见表1。
饲料制成后于-20 ℃保存，为保证试验的准确，根据Ran C.[10]的方法定时测定活菌总数以确保每日活菌数符合试验要求，具体结果见图1。
1.3 饲养管理
饲养试验是在大连海洋大学农业部北方重点试验室进行，试验所用大菱鲆幼鱼购买于大连天正集团养殖场，试验共进行60 d，具体操作及要求如下。试验前将大菱鲆暂养两周适应环境。试验前禁食24 h，试验分为三组，每组三个重复，共九个200 L方形蓝色聚乙烯水槽，每个放养20尾鱼，初始体重为（20.04±0.23） g。每日投喂两次，分别为7：30和16：30，采取表观饱食投喂。试验中投喂颗粒饲料，根据图2所示，20 d后活菌数有所下降已经不能达到试验要求，因此需更换饲料。每日投喂前，利用虹吸法吸取残饵粪便，每日的投喂量需进行称重。驯养及正式试验均采用静水养殖，每日换水两次以保证水质要求（9：30和18：00），日换水量为总体的40%～60%，24 h充气。饲养期间保证光照一致，试验期间定期测定养殖水体盐度，每周测定养殖水体溶氧、温度和pH值。试验期间水温为17.8±1.23 ℃、溶氧为6.96±0.71 mg/L、pH值为8.20±0.20，盐度32.00±2.00‰。
图1 Log10的饲料中复合益生菌总数
1.4 试验样品的采集
试验结束后，对大菱鲆的生长指标进行测定，测定前大菱鲆需停食24 h，以确保鱼腹中没有残余饵料从而引起误差。将水槽中的所有大菱鲆取出，用干净的纱布擦去表面的水分进行称量，计算增重率、饲料系数、特定生长率、肥满度。从每个试验组的三个平行中随机选取5尾鱼于冰盘上取其内脏测定其肝体比、脏体比，并进行尾部取血，采集到的血液分为两个部分：一部分加入肝素钠抗凝剂，用于测定血常规。另一部分血液于4 ℃静置，4 000 r/min离心10 min，取上清液，储存于-80 ℃ 超低温冰箱中，用于血清生化指标分析。此外在各水槽中随机选取5尾鱼用于测定肌肉和鱼体的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分。
1.5 生长及摄食指标的测定
摄食期间鱼的体增重率、特定增长率、饲料系数、肥满度、脏体比、肝体比、肠体比、成活率分别按以下公式计算。
体增重率（%）=[（Wt-W0）/W0]×100
特定增长率（%/d）=[（lnWt-lnW0）/t]×100
饲料系数=C/Wt-W0）
肥满度=（W/L3）×100
脏体比（%）=内脏重量/Wt×100
肝体比（%）=肝脏重量/Wt×100
肠体比（%）=肠道重量/Wt×100
成化率（%）=成活尾数/总尾数×100
其中W0为实验中的初始体重，Wt为实验鱼的终末体重，t为实验天数，C为摄食量，W为实验鱼体重量，L为鱼体长度。
1.6 鱼体及饲料成分分析
饲料、鱼体及其肌肉的成分分析参考Liu 的方法[12]。其中水分含量按照国标GB/T 6435-1986 测定，粗蛋白含量按照国标 GB/T 6432-1994 测定，粗脂肪含量按照国标 GB/T 6433-1994 测定，粗灰分含量按照国标GB/T 6438-1992 测定。
1.7 血液生理指标测定
大菱鲆血液的主要生理指标包括：白细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞体积、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度。这些指标的测定委托大连市体检中心进行检测，通过西斯美康XE-2100D（日本）直接测得。
1.8 血清生化指标测定
大菱鲆血清的主要生化指标包括：总蛋白、白蛋白、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸转移酶。这些指标的测定均由大连市体检中心进行检测，通过西斯美康XE-2100D（日本）直接测得。
1.9 数据分析
数据以平均值±标准误差（Mean±SE，n=3）表示，试验结果用SPSS 21.0 软件进行单因素方差分析 ，用Turkey’s多重比较对全部处理进行方差分析，检验组间差异是否显著，以P<0.05 为显著性差异。
2 试验结果与分析
2.1 复合益生菌对大菱鲆生长性能的影响
饲料中添加了复合益生菌对大菱鲆生长性能的影响见表2。由表可知饲养试验结束后，饲料中添加了复合益生菌对大菱鲆的生长是有显著性影响的。具体结果如下：与对照组（T0）相比，饲料中添加复合益生菌的处理组（T1和T2）的终末体重、特定生长率、增重率有显著性增加（P<0.05），且添加5% 的复合益生菌的处理组（T2）的终末体重、特定生长率、增重率较添加1% 的复合益生菌的处理组（T1）显著增加（P<0.05）。
2.2 复合益生菌对大菱鲆形体指标的影响
饲料中添加复合益生菌对大菱鲆形体指标的影响见表3，由表可知饲养试验结束后，与T0相比，T1和T2的肥满度有显著增加（P<0.05），而脏体比、肝体比、肠体比并无显著性差异（P>0.05）。T1与T2比较，肥满度、脏体比、肝体比、肠体比并没有显著增加（P>0.05）。
2.3 复合益生菌对大菱鲆鱼体及背部肌肉成分的影响
饲料中添加复合益生菌对大菱鲆鱼体及背部肌肉成分的影响见表4。
由表對大菱鲆鱼体成分分析可知与T0对比，T1和T2的粗蛋白是有显著增加（P<005），水分、粗脂肪、粗灰分没有显著性差异 （P>0.05）。T1与T2对比，水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分是没有显著增加（P>0.05）。
针对于大菱鲆背部肌肉成分，由表可知T1和T2的粗蛋白与T0对比显著增加（P<0.05）。其次与T0相比较，T1的粗灰分是没有显著增加 （P>005），而T2的粗灰分是有显著下降（P<0.05）。此外T1和T2的水分、粗脂肪和T0相比没有显著性差异。T1与T2之间相对比，水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分没有显著性差异（P>0.05）。
2.4 饲料中添加复合益生菌对大菱鲆血液部分生理指标的影响
饲料中添加不同梯度的复合益生菌对大菱鲆血液生理指标的影响见表5，如表所示，与对照组相比，处理组T1和T2的大菱鲆血液中白细胞数目、红细胞数目、红细胞压积、平均红细胞体积、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度均没有显著性的差异（P>0.05）。对处理组T1和T2的大菱鲆血液生理指标进行分析，也没有显著性的差异（P>0.05）。
2.5 饲料中添加复合益生菌对大菱鲆血液部分生化指标的影响
饲料中添加不同梯度的复合益生菌对大菱鲆血液生化指标的影响见表6，如表所示，与对照组相比，处理组T1和T2的大菱鲆血液中总蛋白，白蛋白，总胆固醇，高密度脂蛋白胆固醇，低密度脂蛋白胆固醇，丙氨酸氨基转移酶，天门冬氨酸转移酶的含量并没有显著性差异（P>0.05）。对处理组T1和T2的大菱鲆血液生化指标进行分析而得没有显著性的差异（P>0.05）。
3 讨论
3.1 饲料中添加复合益生菌对大菱鲆生长的影响
从 kozasa[13]首次将微生态制剂应用于水产养殖业以来，益生菌制剂开始被作为添加剂添加于饲料当中，并随着对益生菌研究的日益深入，其应用也日益广泛。有研究表明，饲料中添加复合益生菌可促进水产动物的生长[14-16]，但复合益生菌对大菱鲆生长的影响很少报道，因此本研究就饲料中添加不同梯度的益生菌对大菱鲆生长的影响进行探讨，试验结果表明为期60 d的饲养试验结束后，相对于对照组而言，含有复合益生菌的处理组的终末体重、增重率、特定生长率均有所提高，且饲料系数均有所下降。不同添加量的复合益生菌处理组之间在终末体重、增重率、特定生长率、饲料系数指标上也有显著性的差异，表现为T2组的终末体重、增重率、特定生长率高于T1组。此结果说明将复合益生菌作为饲料添加剂能有效地促进大菱鲆的生长，提高饲料利用率，且添加量的不同表现为不同的生长性能与饲料利用率。
与本试验结果相似的研究报道有很多。且研究发现复合益生菌的添加比单一益生菌更能促进水产动物的生长，如报道中指出复合益生菌作为饲料添加剂对大菱鲆的生长，饲料利用率均有明显提高[17]，赖凯昭的研究也表明添加复合益生菌的处理组明显比对照组罗非鱼的终末体重、增重率、特定生长率高[18]，上述试验结果的出现与益生菌促进水产动物生长的作用机理息息相关，目前研究发现益生菌对水产动物促生长的机理主要有以下两个观点：1、益生菌在水产动物肠道内定植，抑制和消除肠道内有害菌和病原菌，从而使肠道处于良好的稳定的微生态环境中，利于营养物质的吸收和消化，从而促进生长[19-20]。2、益生菌可以分泌维生素、氨基酸、促生长因子等，如分泌代谢酶类，补充内源性酶或将鱼体不能吸收的大分子物质分解为易吸收的小分子物质，进而促进鱼体生长，且其本身含有丰富的蛋白质、矿物质等，以补充机体所需的营养成分[21-22]。
本试验的结果中还表明饲料中添加复合益生菌对大菱鲆的形体指标有一定的影响，具体表现为添加复合益生菌的处理组的肥满度指数要高于对照组，对肝体比、肠体比、脏体比三个指数而言，对照组与处理组之间并没有显著性差异。此外添加复合益生菌的处理组T1与T2之间在肥满度、肝体比、肠体比、脏体比方面并没有显著性差异。该试验结果与王朝瑾[23]等研究的试验结果有所不同，其研究结果表明添加不同梯度的复合益生菌对鲫鱼的肥满度、肝体比、肠体比、脏体比均有所提高。而产生上述试验结果的不同的原因主要有两个：首先益生菌的种类和添加量、试验动物种类和规格的不同，且益生菌的活性及其对水产动物作用还受到养殖环境如盐度、温度等因素的影响[21]。其次根据高露姣等[24]和杨金海等[25]研究报道指出肝脏是动物储存营养和中间代谢的主要器官，肠是主要消化器官，而益生菌对水产动物的不同消化器官的作用是不同的。综上所述这些可能是导致水产动物形体指数和内脏指数产生各种变化的原因。
3.2 饲料中添加复合益生菌对大菱鲆体成分的影响
目前，关于益生菌对水产动物的体成分影响的研究报道不一致。张雯等[26]研究发现添加微生态制剂的处理组的肝脏粗脂肪含量明显低于对照组，其他营养成分指标并没有显著性差异。而本试验结果表明60 d 的饲养试验结束后，经复合益生菌处理的试验组中，大菱鲆全鱼及肌肉的粗蛋白含量较对照组有显著性的提高；与对照组相比，T1组的粗灰分含量没有显著性变化，T2组的粗灰分含量有所降低。上述试验的不同结果可能由于益生菌的来源、种类、浓度，以及添加的比例，试验动物的种类等多种因素造成的[21]。就本试验的结果进行分析可能的原因在于益生菌在进入消化道后，能够分解产生动物生长过程中所必需的营养物质，有报道指出益生菌能够提高肠道消化酶活性，促进水产动物对营养物质的消化吸收，增强机体对蛋白质的沉积[26]，因此处理组中大菱鲆及其肌肉粗蛋白的含量显著高于对照组。但是有关本试验中处理组大菱鲆肌肉灰分含量减少的研究尚未报道，具体的机理还需进一步研究。
3.3 饲料中添加复合益生菌对大菱鲆血液生理生化指标的影响
血液中的生理生化指标反映了机体的健康状况、营养状况以及防御有害物质的能力[27]。苏联学者普契科夫及费多洛娃[28]研究表明食物的成分会对血液产生影响。因此本试验通过饲料中添加复合益生菌对大菱鲆血液的影响进行研究，结果表明对T0、处理组T1和T2的大菱鲆血液生理生化指标进行对比并没有显著性的差异。目前有关益生菌对鱼类血液生理生化指标的研究结果各不相同，黄永春[29]等研究发现饲料中添加EM菌可以使建鲤血液的红细胞和血红蛋白升高。与之不同的是袁丰华[30]等在研究地衣芽孢杆菌对尖吻鲈血液生理生化指标的影响时发现，摄食不同地衣芽孢杆菌含量的尖吻鲈血液中红细胞、白细胞数量、血红蛋白的含量与对照组并没有显著性差异，添加地衣芽孢杆菌的量为3.0 g/kg的饲料组其生化成分中胆固醇显著低于对照组， 其他各试验组均与对照组差异不显著。上述实验结果的不同可能是由于试验动物的不同、益生菌的不同、养殖模式以及养殖环境中如溶氧、pH值的不同等诸多因素造成的[21]。但针对于本试验来讲，饲料中添加复合益生菌的浓度不足以改变大菱鲆血液生理生化指標，这可能是造成本试验结果的原因之一，而最适宜的浓度尚未得知以及复合益生菌对大菱鲆血液影响的机理尚不明确，还需要进一步的研究。
4 小结
该复合益生菌作为饲料添加剂是可以有效提高大菱鲆的增重率、特定生长率、饲料利用率，但并没有影响大菱鲆血液生理生化指标。该结果说明复合益生菌的添加对大菱鲆是有利的，没有带来不利影响。但是该复合益生菌的作用机理尚未得知，因此该研究还需进一步进行。
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