鲫鱼肠道蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特征
计划（编号：201610061044）。
作者简介：陈 丰（1993—），男，福建霞浦人，硕士研究生，研究方向为水产动物疾病学。E-mail：chenfeng08091204@163.com。
通信作者：孙敬锋，博士，教授，研究方向为水产动物病害及免疫学。E-mail：sun_jf@163.com。
动物肠道菌群是一个复杂且庞大的微生态系统[1]，不同动物肠道菌群的组成结构多种多样，并且不同类群的微生物数量和分布各不相同[2]。在鱼体中，肠道菌群既参与营养物质的吸收与消化，又具有免疫防御、维持机体健康等功能，对鱼类生长发育起到重要作用[3]。鱼类生活的环境和鱼类消化道中存在着大量的微生物，在鱼类生长发育过程中，鱼类消化道逐渐形成了一个由好氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌组成的动态正常菌群。但当出现机体抵抗力下降、饵料或养殖环境恶化等应激状态时，肠道微生物区系平衡被破坏，病原菌或条件致病菌就会异常增殖，导致鱼类产生各种疾病[4]。
芽孢杆菌（Bacillus）是鱼类肠道正常菌群的重要组成部分，其中一些种类，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）作为益生菌在水产养殖过程中被广泛应用[5-6]。近年来，蜡样芽孢杆菌（B. cereus）作为益生菌的应用也逐渐增多[7-9]。然而，不少研究者从患病鱼病灶或实质内脏器官中分离到蜡样芽孢杆菌，并证明其具有致病性，如陈红莲等从斑点叉尾的肝、脾、肾中分离别蜡样茅孢杆菌[10];贺胜英等从大鲵的鳃、肝、肾中分离到蜡样芽孢杆菌，并证明是引起发病的病原菌[11]。目前，也有研究者从鱼类肠道中分离到非致病性蜡样芽孢杆菌菌株，并可作为益生菌应用[12]，但未见从鱼类肠道中分离到致病性蜡样芽孢杆菌的报道。本研究从鲫鱼肠道中分离出1株致病性蜡样芽孢杆菌，并對其进行分类鉴定及生物学特征研究。这对蜡样芽孢杆菌引起的鱼类疾病的防治及其作为益生菌时的安全性评估具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 细菌的分离培养及形态学观察
健康鲫鱼，体长15 cm，体质量450 g，从天津市某大型水产批发市场购得。用医用乙醇棉球擦拭鱼体表之后，用无菌解剖器具对鱼体进行解剖，取鱼中后肠，用无菌生理盐水冲洗肠道内容物，剪开肠道，刮取肠内膜于组织匀浆器中，加入1 mL 无菌生理盐水进行组织匀浆，然后把匀浆液按10-1～10-4稀释。取100 μL均匀涂布于LB固体培养基上，于37 ℃恒温培养24 h后，重复划线接种培养2～3次，得到纯的菌株，使用革兰氏染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）染色，镜检，选取1株具有芽孢的革兰氏阳性杆菌进一步纯化保存，命名为CS4。
1.2 生理生化特征
参考文献[13-14]，对分离菌株进行生理生化特征测定，包括明胶液化、尿素、硝酸盐还原、硫化氢、淀粉水解、甘露醇、果糖、乳糖、木糖、葡萄糖、麦芽糖、伏-普（V-P）试验等。
1.3 16S rDNA基因序列分析
参考Queipo-Ortuo等的方法[15]提取DNA模板，以细菌通用引物进行16S rDNA基因的PCR扩增。通用引物如下：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1 492R，5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR扩增反应体系（25 μL）包括Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，超纯水11 μL。PCR扩增反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环30 次;72 ℃延伸10 min。扩增反应完成后，取5 μL PCR扩增产物，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。菌株16S rDNA的PCR扩增产物测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。测得的序列在GenBank数据库中进行BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）同源性比对分析。利用软件MEGA 5.0中的邻接（Neighbor-Joining）法构建系统发育树。
1.4 致病性检测
1.4.1 溶血性试验
参考杨志平等的方法[16]对菌株CS4进行溶血性试验。
1.4.2 攻毒试验
健康鲫鱼于2016年8月17日由天津市西青区某鲫鱼养殖场购得。在天津农学院循环水实验室暂养7 d后，选取体长为10～15 cm、大小规格一致的90尾健康鲫鱼，随机分为6组，其中每组15尾。选取其中5组分别注射浓度为2.82×106、2.82×107、2.82×108、2.82×109、2.82×1010 CFU/mL的菌液，注射剂量为0.1 mL。另外1组注射0.1 mL 无菌生理盐水作为对照。在试验期间连续充氧，水温保持在23～25 ℃，每天观察记录鱼死亡情况，并及时捞捡死亡个体，连续观察9 d。对刚死亡的病鱼立即在無菌条件下进行细菌分离。采用Karber法计算菌株对健康鲫鱼的半数致死浓度（LD50）[17]。
1.5 药敏试验
根据Han等的纸片扩散法[18]，用36种含不同抗生素的药敏纸片（杭州滨河微生物试剂有限公司）进行试验，具体如下：氨苄西林（10 μg）、哌拉西林（100 μg）、羧苄西林（30 μg）、苯唑西林（1 μg）、阿莫西林（10 μg）、头孢孟多（30 μg）、头孢呋辛（30 μg）、头孢噻肟（30 μg）、头孢克肟（5 μg）、呋喃妥因（300 μg）、呋喃唑酮（300 μg）、复方新诺明（23.27 μg）、利福平（5 μg）、甲硝唑（5 μg）、新生霉素（30 μg）、强力霉素（20 μg）、四环素（30 μg）、米诺环素（30 μg）、恩诺沙星（5 μg）、林可霉素（2 μg）、克林霉素（20 μg）、氯霉素（30 μg）、氟苯尼考（30 μg）、环丙沙星（5 μg）、依诺沙星（10 μg）、诺氟沙星（10 μg）、萘啶酸（30 μg）、左氟沙星（5 μg）、红霉素（15 μg）、庆大霉素（10 μg）、丁胺卡那（30 μg）、链霉素（10 μg）、新霉素（30 μg）、卡那霉素（30 μg）、万古霉素（30 μg）、亚胺培南（10 μg）。试验结果依据生产公司的抑菌范围解释标准说明书进行判断。
2 结果与分析
2.1 菌株形态特征
菌株CS4菌落呈蜡样状，白色有光泽，表面光滑，挑起时呈丝状（图1-a）。革兰氏染色后镜检表明，菌株CS4为革兰氏阳性杆菌（图1-b）。
2.2 生理生化特性
由表1可知，菌株CS4的明胶液化、硝酸盐还原和V-P试验结果显示为阳性，尿素、硫化氢、淀粉水解和甘露醇试验结果显示为阴性，可利用乳糖、葡萄糖、麦芽糖和果糖，不可利用木糖。
2.3 16S rDNA基因序列分析和系统发育树
由图2可知，菌株CS4的16S rDNA基因PCR扩增产物大小为1 440 bp，将16S rDNA序列在GenBank中进行同源性检索显示，该菌株与B.cereus（登录号：JN700111.1）的同源性为99.65%。通过构建系统发育树，由图3可知，CS4与模式菌株B.cereus（登录号：AE016877.1）和B.cereus（登录号：JN700111.1）聚在一起。
2.4 致病性
溶血性试验，由表2可知，菌株CS4具有溶血性，为β溶血（完全溶血）。攻毒试验结果表明，在菌液浓度为2.82×106、2.82×107、2.82×108、2.82×109、2.82×1010 CFU/mL时，鲫鱼的死亡率分别为7%、20%、27%、27%、60%。在9 d时，半数致死量（LD50）为4.6×106 CFU/g。病理性特征表现为鱼体表充血，胸鳍及臀鳍基部充血（图4-a），腹部隆起且伴有点状充血（图4-b），腹腔内严重出血（图4-c），鳃盖局部出血（图4-d）。随后从致死鲫鱼内脏中重新分离出蜡样芽孢杆菌，其生理生化特征与菌株CS4一致。
2.5 药敏试验
由表3可知，菌株CS4对复方新诺明、呋喃妥因、强力霉素、利福平、呋喃唑酮、头孢孟多等16种药耐药;对四环素、米诺环素、恩诺沙星等3种药中度敏感;对红霉素、环丙沙星、万古霉素、氯霉素、克林霉素、左氟沙星等17种药敏感。
3 讨论
3.1 菌株CS4的分离鉴定
随着我国水产养殖业迅速发展和集约化养殖模式的推广应用，水产动物疾病发生频繁。由于微生态制剂能够抑制病原微生物、促进水产动物生长和预防疾病，同时具有无残留、无污染等优点，近年来被广泛应用于水产养殖行业中[19]。但是使用包括蜡样芽孢杆菌在内的益生菌作为微生态制剂的安全性研究目前未引起足够重视。本研究从鲫鱼肠道分离获得菌株CS4，经过形态学观察及生理生化试验，参照东秀珠等的研究结果[14]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[20]，初步判断菌株CS4为蜡样芽孢杆菌。由于16S rDNA基因序列长度适中，遗传信息丰富，既有保守区，也存在种间变异，适合进行细菌分类鉴定和系统发育进化分析[21]。所以本研究通过16S rDNA基因序列分析对菌株CS4的种属进行进一步确认。结果表明，该菌株与蜡样芽孢杆菌B.cereus（登录号：JN700111.1）的同源性高达99.65%，在系统发育树上与模式菌株B.cereus（登录号：AE016877.1）聚为1支，故进一步确认菌株CS4为蜡样芽孢杆菌。
3.2 菌株CS4的致病性
菌株CS4具有β溶血性特点，表明其具有潜在致病力。根据Santos等的标准，当菌液剂量为1.7×104～1.0×106 CFU/g时，如可致鱼类死亡，判定该菌株具有较强致病性[22]。菌株CS4对鲫鱼的半数致死剂量（LD50）为4.6×106 CFU/g，表明菌株CS4具有较强致病力，对鱼类健康构成较强威胁。并且攻毒鲫鱼的体表病理症状与由蜡样芽孢杆菌引起的斑点叉尾暴发性败血症[10]、黄颡鱼“红头病”[23]、半滑舌鳎典型临床出血症[24]的病理症状相似。但攻毒鲫鱼的腹腔出血病理特点在以往报道中没有发现。不同鱼类中的致病性蜡样芽孢杆菌的致病因子以及致病机制有待进一步研究。
3.3 菌株CS4的药物敏感性
药敏试验可为疾病防治及科学用药提供重要参考依据。菌株CS4对碳青霉烯类、糖肽类、氨基糖苷类、大环内酯类、林克酰胺类和喹诺酮类中的17种抗生素敏感，对头孢菌素类、香豆素类、硝基呋喃类和磺胺类抗生素中的16种药物耐药。虽然部分抗生素如氯霉素、红霉素、呋喃唑酮等在养殖过程中已被禁用，但对蜡样芽孢杆菌的药物抗性研究及其分类地位鉴定仍具有重要指导意义。菌株CS4的药敏试验结果与陈红莲等关于具有致病性蜡样芽孢杆菌的药物敏感性研究结果[10，25]一致。菌株CS4对绝大多数头孢类及磺胺类抗生素具有较强耐药性，这应当引起人们重视。在实际用药时应严格执行国家有关渔药的使用规定及政策，适量适度使用，避免抗生素滥用及违禁药物的使用，防止病原菌产生耐药性，避免对生态以及人体健康造成间接影响。
本研究首次从鲫鱼肠道中分离到致病力较强的蜡样芽孢杆菌菌株，并对其进行生物学特征研究，可以为蜡样芽孢杆菌引起的鱼类疾病防治及其作为益生菌时的安全性评估提供参考。
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