3,株乳杆菌发酵籼米粉浆及其产酶特性（附一株植物乳杆菌MMB-03筛选鉴定及抑菌特性研究）（完整）
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乳酸菌是一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，可利用碳源发酵产生乳酸。在乳酸菌中，乳杆菌是最大的一个属。乳杆菌一般利用葡萄糖和乳糖等还原糖作为碳源，但在某些环境下也可利用非还原糖如淀粉和蔗糖，通过产淀粉酶与蔗糖酶等酶系，将非还原糖转化为还原糖，以供自身利用，目前己有较多乳杆菌利用多糖或二糖作为碳源的文献报道。乳杆菌可利用淀粉作为碳源在大米淀粉体系中发酵，广泛应用于以淀粉为主要原料的发酵类食品中。研究乳杆菌降解大米淀粉的能力具有一定的应用价值，可为制作大米发酵食品提供新的菌种和发酵工艺思路。籼米粉浆是制作传统大米发酵食品的一种前体，为了使籼米粉浆经发酵后的风味更为多样化，需要探究不同种类的产淀粉酶乳杆菌，及其在籼米粉浆中的生长状况。
通过预实验筛选 3 株具有降解淀粉能力的乳杆菌为嗜酸乳杆菌 14（La）、干酪乳杆菌 M（Lc）与植物乳杆菌 115（Lp），构建嗜酸乳杆菌-籼米粉浆发酵体系（La-IRFS），干酪乳杆菌-籼米粉浆发酵体系（Lc-IRFS）和植物乳杆菌-籼米粉浆发酵体系（Lp-IRFS），研究 3 种乳杆菌在籼米粉浆体系中的单菌发酵过程，及其所产淀粉酶嗜酸乳杆菌淀粉酶（La-a）、干酪乳杆菌淀粉酶（Lc-a）和植物乳杆菌淀粉酶（Lp-a）的酶学特性。分析比较 3 株乳杆菌在籼米粉浆中的生长能力，降解淀粉能力，产淀粉酶活力。同时，研究 3 株乳杆菌所产淀粉酶的酶学特性，包括其最适反应温度和 pH 值、耐高温能力与 pH 值稳定性，以期对大米发酵食品的发酵工艺起一定指导作用。
1 乳杆菌发酵过程分析 1.1 3 株乳杆菌的生长曲线结果显示，3 株乳杆菌在籼米粉浆中生长状况良好，La 活菌数增长速率明显快于 Lc 与 Lp，在 2～8 h 阶段活菌数翻倍，在发酵8 h 后生长开始趋于平缓，活菌数变化较小；Lc 与 Lp 活菌数变化趋势相近，在2～8 h 的阶段活菌数增长较快，但增长量明显小于 La，发酵 10 h 后生长趋于平缓。在发酵 12 h 后 La 的活菌数可达 2.3×1010 CFU/mL，Lc 与 Lp 的活菌数皆达1.9×1010 CFU/mL。
1.2 灭菌及发酵前后淀粉颗粒形态的变化 由图 2 可看出，灭菌前后淀粉颗粒变化不大，淀粉在灭菌后仍保持完整颗粒，没有出现涨破的现象，说明本实验的灭菌方法不会使籼米粉中的淀粉糊化，其仍为生淀粉。
由图 3 可看出，与发酵前相比，经 3 株乳杆菌发酵后的籼米粉浆中淀粉颗粒的形态均有不同程度的破裂，这说明 3 株乳杆菌都具有一定降解生淀粉的能力，可产淀粉酶使淀粉中的α-1，4-糖苷键水解生成小分子糊精，这一过程会使淀粉颗粒形态遭到破坏，因而在显微镜下呈现出许多淀粉颗粒破裂呈糊的状态。3 株乳杆菌发酵 6 h 后，显微镜下均可观测到小面积的淀粉颗粒破裂，发酵 12 h后，均可观测到较大面积的淀粉颗粒破裂，可见随发酵时间的延长有更多淀粉被乳杆菌所产的淀粉酶酶解导致结构崩坏。
1.3 发酵前后淀粉含量的变化 由图 4 可得，经 3 株乳杆菌发酵过后，乳杆菌-籼米粉浆体系中的总淀粉含量均显著降低，进一步证实 3 株乳杆菌都有一定利用生淀粉作为碳源的能力。通过总淀粉含量降低的速率可知，3 株乳杆菌中 La 降解生淀粉的能力较强，Lc与 Lp 较弱。在发酵时间为 4～8 h 阶段，La 降解淀粉的速率最快，6～8 h 阶段，Lc 与 Lp 降解淀粉速率最快，这是由于 4～8 h 期间 La-a 活力最大，6～10 h 期间Lc-a 与 Lp-a 活力最大。发酵 12 h 后，La-IRFS 中直链淀粉在总淀粉中占比从 30% 增大到 60%，Lc-IRFS 和 Lp-IRFS 中直链淀粉在总淀粉中的占比则从 30%增大到55%，随着总淀粉含量的降低，直链淀粉在总淀粉中的占比增大，说明在体系中淀粉酶活力较高时，直链淀粉的占比迅速上升。
1.4 3 株乳杆菌产淀粉酶的粗酶活力 由图 5 可得，La-a 活力在发酵第 6 小时达最大，为 79.78 U/mL，整个发酵过程中 4～8 h 时酶活力较大，相对应的该阶段 La 活菌数增长速率最快，这是因为在淀粉酶的作用下 La-IRFS 体系内还原糖含量显著增大，可直接利用的碳源充足，La 的生长环境最佳。而 Lc-a 与 Lp-a 活力则在 8 h 达最大，分别为 51.89 U/mL和 68.77 U/mL，同样，6～10 h 阶段 Lc-IRFS 与 Lp-IRFS 中充足的还原糖使得该阶段 Lc 与 Lp 活菌数增长速率最快。
1.5 pH 值与总酸测定结果 由图 6 可得，3 种乳杆菌在籼米粉浆中均具有一定产酸能力，Lc 的产酸能力与 Lp 相近，而 La 的产酸能力强于 Lc 和 Lp，发酵 12 h 后能使 La-IRFS 体系的 pH 值降至 4.0 以下，而 Lp-IRFS 与 Lp-IRFS 的 pH 值则在 4.5 以上；发酵 12 h后 La-IRFS 的总酸约为 5%，Lp-IRFS 与 Lp-IRFS 总酸皆低于 4%。其中，La-IRFS的 pH 值在 4～8 h 下降最快，总酸升高最快。Lc-IRFS 与 Lp-IRFS 的 pH 值下降速率及总酸升高速率在 6～10 h 最快。
2 3 种淀粉酶的酶学特性 2.1 温度与 pH 值对 3 种淀粉酶的影响 从图 7 可看出，温度为 55 ℃时 La-a 活力最大，大于 90 U/mL，30～70 ℃范围内La-a活力变化不大，因而La-a的较适温度范围为30～70 ℃；温度为45 ℃时 Lc-a 活力最大，约为 65 U/mL，40～60 ℃为 Lc-a 的较适温度范围；温度为50 ℃时 Lp-a 活力最大，约为 80 U/mL，35～65 ℃为 Lp-a 的较适温度范围。La-a在 30～50 ℃与 60～70 ℃活力仍保持较高，Lc-a 和 Lp-a 在较低或较高温度时活力较低，且在 70 ℃时最低，分别低于 20 U/mL 和 40 U/mL，说明 La-a 受温度的影响较小，Lc-a 和 Lp-a 受温度的影响较大。
从图 8 可看出，La-a 和 Lp-a 的最适 pH 值为 6，该 pH 值下其酶活力分别大于 85 U/mL 和 95 U/mL，Lc-a 的最适 pH 值为 7，该 pH 值下酶活力约为 80 U/mL。La-a 在较低与较高 pH 值下仍保持较高的酶活力，在 pH 值为 3、4、9 时酶活力都在 65 U/mL 以上；而 Lc-a 和 Lp-a 在较低或较高 pH 值时，酶活力明显较低。综上表明，La-a 活力受 pH 值的影响较小，Lc-a 和 Lp-a 受 pH 值的影响较大，三者皆为中性酶。
2.2 3 种淀粉酶热稳定性 结果显示，La-a 在 50～60 ℃处理 180 min 仍保持 80%左右的相对酶活力，但当温度升高至 70 ℃以上时，酶活力快速下降，经 70 ℃处理 60 min 后相对酶活力降至 50%左右，180 min 后相对酶活力降至 30%，80 ℃以上处理 60 min 相对酶活力即降至 20%左右，180 min 后几乎完全失活。可见 La-a 在 50～60 ℃酶活力非常稳定，但不可耐受 70 ℃以上的高温，80 ℃以上则失活速率极快。结果显示，Lc-a 在 50 ℃处理 180 min 仍保持有 60%以上的相对酶活力，在 60 ℃处理 180 min 后降至 40%，70、80、90 ℃处理 60 min 后相对酶活力分别降至 40%、30%、20%以下，在 70 ℃以上处理 180 min 后几乎完全失活。即 Lc-a 在 50～60 ℃范围内具有一定耐热能力，70 ℃以上时失活速率较快。结果显示，Lp-a 在 50 ℃处理 180 min 后仍保持 90%的相对酶活力，在 60℃处理 180 min 后仍保持有 60%以上的相对酶活力，在 70 ℃处理 60 min 后降至 40%左右，80 ℃以上处理 60 min 后仍有超过 30%的相对酶活力，处理 180 min 后几乎完全失活。可见 Lp-a 可长时间耐受 50 ℃的温度，在 60 ℃也具有一定耐热性，不可耐受 70 ℃以上的高温，70 ℃以上时失活速率较快。比较 3 种乳杆菌所产的淀粉酶，Lp-a 的耐热性相对最强。
2.3 3 种淀粉酶 pH 值稳定性 结果显示，La-a 在 pH 值为 5 时的稳定性较强，处理 180 min 后仍保持 50%以上的相对酶活力，但 pH 值为 4 或更低时，60 min 后 La-a 相对酶活力降至 50%以下，180 min 后降至 30%以下；La-a 在 pH 值为 8 时的耐碱能力较强，处理 180 min 后仍保持 50%以上的相对酶活力，而当 pH 值增大到 9 时，La-a 失活速率较快，60 min 后降至 50%以下，180 min 后相对酶活力在 20%以下。可见 La-a 在pH 5～8 范围内稳定性较强。结果显示，Lc-a 的耐酸能力差，在 pH 值为 5 时处理 60 min 相对酶活力降至 30%，pH 值为 3 时处理 30 min 相对酶活力降至 30%以下，60 min 后降至 10%以下，pH 值为 4 以下处理 180 min 后几乎完全失活。pH 值为 8 时耐碱能力较好，处理 120 min 后仍保持 50%以上相对酶活力，但 pH值增大至 9 后耐碱能力骤降，处理 60 min 相对酶活力仅为 10%，180 min 后几乎完全失活。可见 Lc-a 的 pH 值稳定性很差，不可长时间处于 pH 6～8 以外的环境中。结果显示，Lp-a 处于 pH 值为 5 和 8 的环境下 120 min 后相对酶活力仍有 50%以上，在 pH 值为 3、4 或 9 的环境下处理 60 min 后相对酶活力即降至 50%以下。在 pH 值为 4、5、8 的环境下 180 min 后，相对酶活力均降至 30%以下，在 pH值为 3 和 9 的环境中 180 min 后，几乎完全失活。可见 Lp-a 的酸碱耐受能力较差，但略优于 Lc-a。
综上可得，La-a 在 3 种乳杆菌所产淀粉酶中 pH 值稳定性最好，Lp-a 次之，Lc-a 的 pH 值稳定性最差。
结论 本实验通过构建乳杆菌-籼米粉浆体系，研究 3 株具有降解淀粉能力的乳杆菌 La、Lc 与 Lp 在籼米粉浆体系中单菌发酵过程，并研究其所产淀粉酶的酶学特性，同时也对发酵过程体系中淀粉含量，直链淀粉占比进行测定。结果表明，3 株乳杆菌中最适合在籼米粉浆体系中生长的为 La，其在经过 12 h 发酵后可使La-IRFS 体系的 pH 值降至 4.0 以下，总酸达到 5%，La 在籼米粉浆体系中的产酸能力强于 Lc 与 Lp，发酵过程中 La 活菌数始终大于 Lc 与 Lp，且所产淀粉酶的最大酶活力亦大于 Lc 与 Lp，能在 6 h 内达到最大。在 3 株乳杆菌所产的淀粉酶中，55 ℃时 La-a 活力最高，45 ℃时 Lc-a 活力最高，而 Lp-a 最适温度为 50 ℃，三者均不可耐受 70 ℃以上的高温，但其中 Lp-a 的耐热性相对较强。La-a 和 Lp-a的最适 pH 值为 6，Lc-a 最适 pH 值为 7，三者皆为中性酶，pH 值稳定性的排序为:La-a＞Lp-a＞Lc-a。发酵过后，乳杆菌-籼米粉浆体系中的总淀粉含量均显著降低，直链淀粉在总淀粉中的占比增大，说明乳杆菌所产淀粉酶中有一定量的异淀粉酶，可将体系中的支链淀粉转化为直链淀粉，从而导致发酵过后直链淀粉的占比增大。初步推测本实验中的 3 株乳杆菌在籼米粉浆体系中由于缺乏碳源进入碳饥饿状态，其与淀粉酶相关的基因被诱导表达，从而拥有生产淀粉酶的能力。
一株植物乳杆菌 MMB-03 的筛选鉴定及抑菌特性研究 关键词：理化性质鉴定 摘要 [目的]从发酵酸鱼中筛选鉴定得到一株产植物乳杆菌素的植物乳杆菌MMB-03，通过研究植物乳杆菌素的酸、温度稳定性及抑菌效果，确定了该植物乳杆菌素的抑菌特性。
[方法]采用形态学、生理生化、16S rDNA 分析鉴定该菌株为植物乳杆菌。采用打孔法测定植物乳杆菌素的抑菌效果。
[结果]该植物乳杆菌素在 pH 4.0～7.0 时均有较强的抑菌活性;121 ℃ 处理20 min 仍有良好的抑菌活性;对指示菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌等均有良好的抑菌效果。
[结论]植物乳杆菌 MMB-03 在水产饲料和食品保藏方面具有良好的应用前景。
关键词 植物乳杆菌;鉴定;细菌素;理化性质;抑菌 Abstract [Objective] A strain of Lactobacillus plantarum MMB 03 was obtained from fermented acid fish. The antibacterial properties of plantaricin from Lactobacillus plantarum MMB 03 were determined by researching acid stability， temperature stablility， and bacteriostatic activity. [Method] The strain was identified as Lactobacillus plantarum by morphology， hysiological and biochemical and 16S rDNA. The bacteriostatic effect of plantaricin was determined by punching. [Result] The plantaricin had strong bacteriostatic activity at pH 4.0-7.0， and had good bacteriostatic activity at 121℃ for 20 min. It also had good bacteriostatic effect on indicator bacteria Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Bacillus cereus. [Conclusion] Lactobacillus plantarum MMB 03 has a good application prospect in aquatic feed and food preservation. Key words Lactobacillus plantarum;Appraisal;Bacteriocins;Physical and chemical properties;Bacteriostatic 乳酸菌在自然界中廣泛存在，是“公认安全”的微生物，其产物已被允许添加到食品工业中[1-2]。细菌素是由核糖体合成的具有抑菌作用的一类蛋白类物质[3]，已被广泛应用在食品工业、动物生产和医疗以及畜禽饲料等领域[4-5] 。乳酸菌生成的细菌素能够有效抑制食品中的腐败菌，延长食品货架期，可被用作生物保鲜剂[6-7]，如乳酸链球菌素（Nisin）已在食品中大量应用[8-9]。
植物乳杆菌是乳酸菌的一种，常见于肉类、奶类及蔬菜的发酵制品中，是人体胃肠道的益生菌群，具有增强机体免疫力、降低胆固醇、预防心血管疾病和促进营养物质吸收等多种功能[10]。植物乳杆菌来源的细菌素被称为植物乳杆菌素，植物乳杆菌素属于 I 类或 II 类细菌素，分子量较小、热稳定性高，可被蛋白酶降解[11]。目前，研究较为深入的植物乳杆菌素有 Plantaricin C、Plantaricin EF、Plantaricin JK[12]。有研究者从传统泡菜、果蔬酱、畜禽肠道[13]中筛选得到植物乳杆菌产生的植物乳杆菌素具有良好的抑菌活性。但目前报道的植物乳杆菌素抑菌谱较窄，限制了其在食品工业中的大规模应用。因此，筛选出产广谱抑菌性植物乳杆菌素的植物乳杆菌，对于开发新的防腐抑菌剂具有重要意义。
供试植物乳杆菌采自实验室自制发酵酸鱼。
1.1.2 指示菌。
大肠杆菌（CICC 10003）、金黄色葡萄球菌（CICC 23656）、蜡样芽孢杆菌 （CICC 23828）、维氏气单孢菌、嗜水...